1、临床医学研究与实践2023 年 3 月第 8 卷第 7 期Value of second-generation gene sequencing technology in detecting CRLF2,FLT3 and C-KIT mutation in patients with acute myeloid leukemiaCHANG Yuanyuan,YANG Yafeng*(Hematology Department,Yulin No.2 Hospital,Yulin 719000,China)ABSTRACT:Objective To explore the value of sec
2、ond-generation gene sequencing technology in detecting cytokinereceptor like factor 2(CRLF2),FMS-like tyrosine kinase 3(FLT3)and C-KIT mutation in patients with acute myeloidleukemia.Methods A total of 78 patients with acute myeloid leukemia treated in our hospital from January 2017 to January2020 w
3、ere selected as the research objects.The CRLF2,FLT3 and C-KIT mutation were detected by second-generationgene sequencing technology.The clinical parameters of patients with different mutation types of CRLF2,FLT3 and C-KITwere compared;the complete remission rate after treatment for 2 courses and rec
4、urrence rate of patients with differentmutation types of CRLF2,FLT3 and C-KIT were compared.Results There were 11 cases of CRLF2 mutation in 78patients,with a mutation rate of 14.10%,the mutation rate of normal karyotype was higher than that of abnormal karyotype,and the difference was statistically
5、 significant(P0.05);there were 9 cases of FLT3 mutation,with a mutation rate of11.54%,the mutation rate of normal karyotype was higher than that of abnormal karyotype,and the difference wasstatistically significant(P0.05);there were 6 cases of C-KIT mutation,with a mutation rate of 7.69%,the mutatio
6、n rate ofnormal karyotype was lower than that of abnormal karyotype,and the difference was statistically significant(P0.05).Therewere significant differences in age,white blood cell count and platelet count among patients with different mutation types ofCRLF2(P0.05);there was significant difference
7、in white blood cell count among patients with different mutation types ofFLT3(P0.05);there was significant difference in hemoglobin level among patients with different mutation types of C-KIT(P0.05);the complete remission rate after treatment for 2 courses of FLT3 mutation positivepatients was lower
8、 than that of mutation negative patients,the recurrence rate was higher than that of mutation negativepatients,and the differences were statistically significant(P0.05);the二代基因测序技术检测急性髓系白血病患者 CRLF2、FLT3及 C-KIT 突变的价值常渊媛，杨亚锋*（榆林市第二医院血液内科，陕西 榆林，719000）摘要：目的 探讨二代基因测序技术检测急性髓系白血病患者细胞因子受体样因子 2（CRLF2）、FMS 样
9、酪氨酸激酶 3（FLT3）及 C-KIT 突变的价值。方法 选择 2017 年 1 月至 2020 年 1 月在我院接受治疗的 78 例急性髓系白血病患者为研究对象，采用二代基因测序技术检测 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 突变情况。比较 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 不同突变类型患者的临床参数；比较 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 不同突变类型患者治疗2 个疗程的完全缓解率和复发率。结果 78 例患者中 CRLF2 突变 11 例，突变率为 14.10%，正常核型突变率高于异常核型，差异具有统计学意义（P0.05）；FLT3 突变 9 例，突变率为 11.54%，正常核型
10、突变率高于异常核型，差异具有统计学意义（P0.05）；C-KIT 突变 6 例，突变率为7.69%，正常核型突变率低于异常核型，差异具有统计学意义（P0.05）。CRLF2 不同突变类型患者的年龄、白细胞计数、血小板计数比较，差异具有统计学意义（P0.05）；FLT3 不同突变类型患者的白细胞计数比较，差异具有统计学意义（P0.05）；C-KIT 不同突变类型患者的血红蛋白水平比较，差异具有统计学意义（P0.05）。开展随访跟踪共计 76 例患者可评价干预效果，CRLF2 不同突变类型患者治疗2 个疗程的完全缓解率和复发率比较，差异无统计学意义（P0.05）；FLT3 突变阳性患者治疗2 个疗
11、程的完全缓解率低于突变阴性患者，复发率高于突变阴性患者，差异具有统计学意义（P0.05）；C-KIT 不同突变类型患者治疗2 个疗程的完全缓解率比较，差异无统计学意义（P0.05）；C-KIT 突变阳性患者复发率高于突变阴性患者，差异具有统计学意义（P0.05）。结论 急性髓系白血病患者 CRLF2、FLT3 及 C-KIT突变较为常见，利用二代基因测序技术开展上述基因突变检测有助于指导临床治疗及预后评估。关键词：二代基因测序技术；急性髓系白血病；细胞因子受体样因子 2；FMS 样酪氨酸激酶 3；C-KIT中图分类号：R733.71文献标志码：A文章编号：2096-1413(2023)07-0
12、097-04DOI:10.19347/ki.2096-1413.202307027作者简介：常渊媛（1989），女，主治医师，硕士。研究方向：血液病学。*通讯作者：杨亚锋，E-mail:.临床医学97-临床医学研究与实践2023 年 3 月第 8 卷第 7 期急性髓系白血病是一种造血干细胞恶性克隆性疾病，发病时患者骨髓中的异常原始细胞以及幼稚细胞会大量增殖，积蓄于骨髓中抑制个体的正常造血，还会广泛浸润肝、脾、淋巴结等髓外脏器，患者的临床表现包括贫血、出血、感染以及浸润等1-4。儿童和成人均可发生急性髓系白血病，如得不到及时有效的治疗，预后较差5-6。近年来，随着遗传学、分子生物学等技术的应用，
13、对急性髓系白血病的遗传学和生物学特性有了进一步的理解，为急性髓系白血病的诊断、治疗方案选择提供了依据。随着研究的深入，发现急性髓系白血病在发生、发展过程中存在包括细胞表面分子异常表达、基因突变和基因异常甲基化等多种细胞分子遗传学及表观遗传学方面的异常，其中基因突变在急性髓系白血病进展中发挥的作用尤为重要7-8，已有研究指出，遗传学特征是影响急性髓系白血病患者预后的最重要的独立因素，如果能够在发病初期筛查出患者基因突变类型，对后续治疗的开展将具有巨大的指导意义9-10。细胞因子受体样因子2（cytokine receptor like factor 2,CRLF2）、FMS 样酪氨酸激酶 3（F
14、MS-like tyrosine kinase 3,FLT3）及C-KIT 突变都是成人急性髓系白血病最常见的基因突变类型：CRLF2 编码一个型细胞因子受体家族成员，编码蛋白是胸腺基质淋巴生成素的受体。FLT3 又称胎肝激酶 2或人干细胞激酶 1，表达于早期髓系/粒系祖细胞、胎盘、脑和性腺中，是型受体酪氨酸激酶家族成员之一。FLT3 配体在造血干/祖细胞的增殖和分化过程中起重要调节作用。C-KIT 是酪氨酸激酶受体蛋白家族的重要成员之一，其可通过一系列信号通路参与造血干细胞的增殖、分化调控11。当前对于以上基因在临床上的研究较少。本研究旨在探究急性髓系白血病患者上述基因突变情况，并探究二代基
15、因测序对基因突变的检测价值，以期为指导急性髓系白血病患者治疗和评估预后提供参考，现将具体内容报道如下。1资料与方法1.1 一般资料选择 2017 年 1 月至 2020 年 1 月在我院接受治疗的78 例急性髓系白血病患者为研究对象，其中男性 39 例，女性 39 例；年龄 4559 岁，平均年龄（48.393.29）岁；FAB分型12：M02 例，M14 例，M2a31 例，M2b17 例，M411 例，M510 例，M62 例，M71 例。本研究经医院伦理协会批准；患者均签署知情同意书。1.2 纳入及排除标准纳入标准：确诊为急性髓系白血病且出现相应临床症状13；无严重肝、肾功能损害；无器官
16、衰竭；无败血症；意识清晰能够配合调研。排除标准：并发精神疾患；并发其他恶性肿瘤；参与其他未结题临床研究；对本研究所用药物过敏。1.3 方法1.3.1 染色体核型分析。采集患者骨髓 56 mL，使用肝素抗凝后按照 2106/L 的密度接种到 3 个培养液中，经短期培养后制备染色体，并进行核型分析，染色体核型异常参考 人类细胞遗传学国际命名体制 进行描述。1.3.2 基因组脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid,DNA）制备及聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增。使用 DNA 提取试剂盒（厂家：济南新美康生物技术有限公司）对患者骨髓单个
17、核细胞 DNA 基因组进行提取，确定DNA 产物浓度后使用去离子水稀释至 50150 ng/L。分别选择 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 试剂盒厂家：天根生化科技（北京）有限公司对上述基因开展 PCR 扩增，并使用测序部分检测试剂盒（厂家：安捷伦科技有限公司）对扩增良好的 PCR 产物开展测序和纯化，分析 CRLF2、FLT3 及C-KIT 基因突变情况。1.4 临床治疗方案对患者采取标准 DA柔红霉素（DNR）阿糖胞苷（Ara-C）、HA高三尖杉酯碱（HHT）阿糖胞苷（Ara-C）、IA甲氧柔红霉素（IDA）阿糖胞苷（Ara-C）等方案干预，2个周期后达到完全缓解的患者，应用其他方案继
18、续干预，干预过程中视患者实际情况开展自体或异基因造血干细胞移植。1.5 观察指标及评价标准（1）分析 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 突变情况，染色体组型包括正常核型、异常核型及未识别。（2）比较 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 不同突变类型患者的临床参数，包括性别、年龄、白细胞计数、血红蛋白、血小板计数、细胞表面分化抗原 117（cell differentiation antigen 117,CD117）、人类白细胞抗原-DR（human leukocyte antigen DR,HLA-DR）。于清晨采集患者空腹静脉血 2 mL，并于无菌试管内保存，静置处理，并校准贝克曼库尔
19、特公司生产的LH-750 全自动血液分析仪以待用，行血常规测定白细胞计数、血红蛋白及血小板计数。抽取患者的骨髓 23 mL，肝素抗凝，采用 BD 公司生产的四色多参数流式细胞仪进行免疫表型分析，检测 CD117、HLA-DR，以 CD45/SSC 设门分析幼稚细胞的比例及抗原表达，以幼稚细胞中抗原表达细胞20%为该抗原表达阳性。（3）比较 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 不同突变类型患者recurrence rate of C-KIT mutation positive patients was higher than that of mutation negative patients
20、,and the differencewas statistically significant(P0.05).Conclusion CRLF2,FLT3 and C-KIT mutation are common in patients with acutemyeloid leukemia.Detection of these mutation using second-generation gene sequencing technology is helpful to guide clinical treatment and prognosis evaluation.KEYWORDS:s
21、econd-generation gene sequencing technology;acute myeloid leukemia;cytokine receptor like factor 2;FMS-like tyrosine kinase 3;C-KIT98-临床医学研究与实践2023 年 3 月第 8 卷第 7 期表 1CRLF2、FLT3 及 C-KIT 突变情况分析（n/%）注：与同基因异常核型比较，*P0.05。基因突变类型例数染色体组型正常核型（n=30）异常核型（n=43）未识别（n=5）CRLF2阳性118/26.67*3/6.980/0.00阴性6722/73.3340
22、/93.025/100.00FLT3阳性97/23.33*2/4.650/0.00阴性6923/76.6741/95.355/100.00C-KIT阳性60/0.00*6/13.950/0.00阴性7230/100.0037/86.055/100.00表 2CRLF2 不同突变类型患者的临床参数比较临床参数阳性（n=11）阴性（n=67）2/tP性别（男/女，n）5/635/320.1740.677年龄（x?s，岁）44.122.1135.232.0913.0580.001白细胞计数（x?s，109/L）60.112.348.211.21113.0360.001血红蛋白（x?s，g/L）79.
23、283.4380.123.210.7970.428血小板计数（x?s，109/L）33.293.2954.294.3318.7390.001CD117（阳性/阴性，n）4/712/551.9730.160HLA-DR（阳性/阴性，n）6/532/350.1740.677表 3FLT3 不同突变类型患者的临床参数比较临床参数阳性（n=9）阴性（n=69）2/tP性别（男/女，n）5/435/340.0740.785年龄（x?s，岁）36.233.2235.224.300.6790.499白细胞计数（x?s，109/L）75.294.318.192.1177.6910.001血红蛋白（x?s，g/
24、L）79.184.5980.113.990.6470.520血小板计数（x?s，109/L）36.284.1135.192.391.1720.245CD117（阳性/阴性，n）2/714/550.0180.893HLA-DR（阳性/阴性，n）4/534/350.0740.785表 4C-KIT 不同突变类型患者的临床参数比较临床参数阳性（n=6）阴性（n=72）2/tP性别（男/女，n）3/337/350.0040.948年龄（x?s，岁）37.873.2236.492.221.4130.162白细胞计数（x?s，109/L）10.121.229.982.100.1600.873血红蛋白（x?
25、s，g/L）62.192.3380.191.9826.6300.001血小板计数（x?s，109/L）29.393.2230.192.390.7670.445CD117（阳性/阴性，n）2/414/580.6550.418HLA-DR（阳性/阴性，n）3/335/370.0040.948注：与同基因阳性比较，*P0.05。表 5CRLF2、FLT3 及 C-KIT 不同突变类型患者治疗2 个疗程的完全缓解率和复发率比较（%）基因突变类型例数 治疗2 个疗程的完全缓解率复发率CRLF2阳性1172.73（8/11）18.18（2/11）阴性6563.08（41/65）18.46（12/65）FL
26、T3阳性933.33（3/9）44.44（4/9）阴性6768.66（46/67）*14.93（10/67）*C-KIT阳性666.67（4/6）66.67（4/6）阴性7064.29（45/70）14.29（10/70）*治疗2 个疗程的完全缓解率及复发率。完全缓解：骨髓象诱导缓解化疗后骨髓涂片原始疗效评估细胞5%；血红蛋白100 g/L（男）或90 g/L（女），中性粒细胞绝对值1.5109/L，血小板计数100109/L；无白血病浸润的症状和体征，生活正常或接近正常。复发：骨髓象达缓解后复查原始细胞5%，于 1 年后统计。1.6 统计学方法采用 SPSS22.0 统计学软件分析数据，计数
27、资料用 n/%表示，用 2检验，计量资料用x?s 表示，用 t 检验或近似 t 检验，以 P0.05 为差异具有统计学意义。2结果2.1 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 突变情况分析78 例患者中 CRLF2 突变 11 例，突变率为 14.10%，正常核型突变率高于异常核型，差异具有统计学意义（P0.05）；FLT3 突变 9 例，突变率为 11.54%，正常核型突变率高于异常核型，差异具有统计学意义（P0.05）；C-KIT 突变 6例，突变率为 7.69%，正常核型突变率低于异常核型，差异具有统计学意义（P0.05）。见表 1。2.2 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 不同突变
28、类型患者的临床参数比较CRLF2 不同突变类型患者的年龄、白细胞计数、血小板计数比较，差异具有统计学意义（P0.05）；FLT3 不同突变类型患者的白细胞计数比较，差异具有统计学意义（P0.05）；C-KIT 不同突变类型患者的血红蛋白水平比较，差异具有统计学意义（P0.05）。见表 24。2.3 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 不同突变类型患者治疗2 个疗程的完全缓解率和复发率比较本研究合计纳入 78 例患者，开展随访跟踪共计 76 例患者可评价干预效果，CRLF2 不同突变类型患者治疗2 个疗程的完全缓解率和复发率比较，差异无统计学意义（P0.05）；FLT3 突变阳性患者治疗2 个
29、疗程的完全缓解率低于突变阴性患者，复发率高于突变阴性患者，差异具有统计学意义（P0.05）；C-KIT 不同突变类型患者治疗2 个疗程的完全缓解率比较，差异无统计学意义（P0.05）；C-KIT 突变阳性患者复发率高于突变阴性患者，差异具有统计学意义（P0.05）。见表 5。3讨论急性白血病是一种临床较为常见的、具有高度异质性的血液系统恶性肿瘤，该疾病形成与电离辐射、病毒感染、遗传等因素密切相关，临床表现则主要以骨骼关节疼痛、出血等为主。该病有起病急骤、并发症较多等特点，其预后较差，对患者健康威胁性较高14-15。急性白血病可分为急性淋巴细胞白血病和急性髓细胞白血病，急性髓系白血病是造血系统的
30、髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病，其特点是原代和未成熟髓系细胞在骨髓和外周血中异常增殖，无法继续发育成熟，抑制骨髓的正常造血功能，是成人最常99-临床医学研究与实践2023 年 3 月第 8 卷第 7 期见的一种白血病。该疾病包括了所有非淋巴细胞来源的急性白血病，是造血系统中髓系原始细胞克隆性恶性增殖性疾病，在正常髓系细胞分化发育中的不同阶段的造血祖细胞出现恶性改变，其诊断、治疗等十分棘手16-19。研究发现，随着分子生物学技术的发展，了解基因遗传学的异常，对于急性髓系白血病患者的分层诊断和治疗具有积极意义20-22。CRLF2、FLT3 及 C-KIT 等基因突变的筛查有助于急性髓系白血病患
31、者的诊断及治疗23-25。当前从遗传学微观层面对以上 3 个基因进行综合性分析的研究甚少，本研究通过二代测序技术检测其突变情况，为急性髓系白血病的治疗提供新的理论基础。本研究纳入 78 例急性髓系白血病患者，就二代基因测序技术检测 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 基因突变的可行性进行了分析，结果显示，在正常核型与异常核型患者中 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 突变率均存在明显差异（P0.05）。本研究中，患者 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 突变率分别为 14.10%、11.54%和 7.69%，CRLF2 和 FLT3 突变主要发生于正常核型中，C-KIT 突变主要发生于异
32、常核型中。分析原因为，CRLF2是一种多功能磷蛋白，能够参与核质间的物质转运，其主要功能包括调控细胞正常增殖与凋亡、维持基因组稳定性等；FLT3 位于 13q12，主要表达于早期髓系细胞中，其编码产物影响着造血祖细胞的正常增殖和分化，在造血干细胞中起重要调节作用，因此以上 2 个基因主要位于正常核型中。而 C-KIT 是干细胞因子，并共同参与了细胞增殖、分化与凋亡的调控进程，导致信号通路持续的激活26。编码急性白血病肿瘤细胞高表达的 C-KIT 分子胞外功能区氨基酸的密码子序列发生变异，使其编码的分子发生变异，导致肿瘤细胞对造血生长因子的敏感性增加，致使恶性克隆过度，进而导致染色体核型异常，所
33、以 C-KIT 主要发生于异常核型中。本研究进一步比较 CRLF2、FLT3 及 C-KIT 不同突变类型患者的临床参数，发现年龄、白细胞计数、血小板计数、血红蛋白可能与突变率有一定的关联。已有研究指出，FLT3 突变患者存在外周血白细胞计数和骨髓原始细胞比例升高的情况27，这与本研究类似，笔者分析认为该结果可以一定程度上为急性髓系白血病患者的临床干预提供参考，但其实际意义仍待进一步的大样本研究验证。最后关于基因突变对急性髓系白血病患者预后的影响，本研究结果提示，基因突变可能降低完全缓解率，升高复发率，说明基因突变往往伴随着患者的预后不良。综上所述，急性髓系白血病患者 CRLF2、FLT3 及
34、 C-KIT突变较为常见，利用二代基因测序技术开展上述基因突变检测有助于指导临床治疗及预后评估。但本研究存在一定局限性，如样本量较少、研究不够深入，将在后续加大样本量，从各层面进行分析，以提高其临床价值。参考文献：1 周竞奋,陈琰,朱振峰,等.急性白血病患者医院感染的临床特点分析J.中华医院感染学杂志,2018,28(7):987-990.2 邢双双,顾则娟,蒋秀美,等.急性白血病临床护理质量评价标准的构建J.中华护理杂志,2018,53(3):324-329.3 冷亚美,陈凤姣,毛凌,等.急性白血病成年患者的生活质量及其影响因素J.国际输血及血液学杂志,2018,41(2):103-109.
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