豆血红蛋白在酿酒酵母中的异源表达.pdf

1、薛常鲁，张鹏飞，白丽君，等.豆血红蛋白在酿酒酵母中的异源表达 J.食品工业科技，2023，44（20）：101107.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022120029XUEChanglu,ZHANGPengfei,BAILijun,etal.HeterologousExpressionofLeghemoglobininSaccharomyces cerevisiaeJ.Scienceand Technology of Food Industry,2023,44(20):101107.(in Chinese with English abstract).doi:10

2、.13386/j.issn1002-0306.2022120029 生物工程 豆血红蛋白在酿酒酵母中的异源表达豆血红蛋白在酿酒酵母中的异源表达薛常鲁1,2，张鹏飞1,2，白丽君1,2，肖功年1,2，魏培莲1,2,*（1.浙江科技学院生物与化学工程学院，浙江杭州310023；2.浙江省农产品化学与生物加工技术重点实验室，浙江杭州310023）摘要：豆血红蛋白是一种植物源血红蛋白，在植物蛋白肉加工中可作为重要的风味催化剂和着色剂，大大增加植物蛋白肉的拟真性。为实现豆血红蛋白在食品级微生物中的异源表达，将携带豆血红蛋白 LBC2 基因的质粒PESC-TRP 转入酿酒酵母 CEN.PK2-1C 中，通

3、过添加 kozak 序列促进其翻译，并进一步对启动子序列进行选择，以提高豆血红蛋白表达量。对重组菌株进行发酵，用 Westernblot 分析 LegH 蛋白表达水平。结果显示，诱导型启动子 GAL1,10 较三种组成型启动子 TEF1、ADH1、GAP 在表达 LegH 能力上具有显著优势，较产量最低的 ADH1 启动子提升了 3.93 倍。在组成型启动子中，TEF1 启动子能力较优，是 ADH1 启动子的 2.91 倍，是 GAP 启动子的1.2 倍。最后，利用 Ni 柱亲和层析对蛋白进行浓缩纯化，测得 LegH 发酵浓度为 2.79mg/L。本研究成功实现了豆血红蛋白在酿酒酵母中的异源表

4、达，经后续优化有可能成为豆血红蛋白异源表达的又一途径。关键词：酿酒酵母，豆血红蛋白，启动子优化，异源表达，蛋白质印迹本文网刊:中图分类号：Q786文献标识码：A文章编号：10020306（2023）20010107DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022120029HeterologousExpressionofLeghemoglobininSaccharomycescerevisiaeXUEChanglu1,2，ZHANGPengfei1,2，BAILijun1,2，XIAOGongnian1,2，WEIPeilian1,2,*（1.ZhejiangUniversi

5、tyofScienceandTechnology,Hangzhou310023,China；2.ZhejiangProvincialKeyLabforChem&BioProcessingTechnologyofFarmProduct,Hangzhou310023,China）Abstract：Leghemoglobinisakindofplant-derivedhemoglobin,whichcanbeusedasanimportantflavorcatalystandcolorantintheprocessingofplantprotein-basedmeatbecauseoftheprop

6、ertyofincreasingthefidelityoftheproductgreatly.Inordertorealizetheheterologousexpressionofleghemoglobininfood-grademicroorganisms,theplasmidPESC-TRPcarryingleghemoglobinLBC2genewastransformedintoS.cerevisiaeCEN.PK2-1C.Kozaksequencewasaddedtopromoteproteintranslation,anddifferentpromotersequenceswere

7、selectedtoimprovetheexpressionofleghemoglobin.Therecombinantstrainwasfermented,andtheexpressionlevelofLegHproteinwasanalyzedbywesternblot.TheresultsshowedthattheinduciblepromoterGAL1,10hadasignificantadvantageoverthethreeconstitutivepromotersTEF1,ADH1andGAPinLegHexpressionability,whichwas3.93timeshi

8、gherthanthelowestyieldADH1promoter.Amongtheconstitutivepromoters,TEF1promoterhadthebestability,whichwas2.91timesthatoftheADH1promoterand1.2timesthatoftheGAPpromoter.Finally,theproteinwasconcentratedandpurifiedbyNi-columnaffinitychromatography,andthefermentationconcentrationofLegHwas2.79mg/L.Thisstud

9、ysuccessfullyachievedtheheterologousexpressionofleghemoglobin in Saccharomyces cerevisiae,and after subsequent optimization,it would become another way ofleghemoglobinheterologousexpression.Keywords：Saccharomyces cerevisiae；leghemoglobin；promoteroptimization；heterologousexpression；westernblot豆血红蛋白（L

10、eghemoglobin，LegH）是豆科植物感染根瘤菌后共同产生的植物源血红蛋白12，由一收稿日期：20221215基金项目：浙江省重点研发计划项目（2020C02041）。作者简介：薛常鲁（1998），男，硕士研究生，研究方向：食品微生物，E-mail：。*通信作者：魏培莲（1976），女，博士，教授，研究方向：食品微生物，E-mail：。第44卷第20期食品工业科技Vol.44No.202023年10月ScienceandTechnologyofFoodIndustryOct.2023条单链脱辅基蛋白和血红素辅基构成，三维结构与动物血红蛋白高度相似3，在植物蛋白肉加工中可以作为风味催化剂

11、和着色剂，大大增加植物蛋白肉的拟真性45。目前，LegH 主要从大豆根瘤中提取获得，但由于工艺复杂、植物种植周期长、含量低等原因，生产成本较高，难以进行大规模生产。因此，利用微生物作为细胞工厂合成血红蛋白是未来的发展方向6，包括豆血红蛋白79、人血红蛋白10、猪肌红蛋白11在内的多种血红蛋白已实现异源表达12。以毕赤酵母作为表达宿主的 LegH 已被美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration，FDA）批准作为“人造肉”中的着色剂1315。但目前豆血红蛋白异源表达的相关研究主要集中于大肠杆菌和毕赤酵母89。大肠杆菌的表达量较低16，存在形成包涵体、血红素供应不足等

12、问题，同时细菌内毒素会使豆血红蛋白结合形成高铁血红蛋白致使蛋白纯化变得更为复杂17。而毕赤酵母为甲醇营养型菌株，在表达过程中需要使用甲醇作为碳源和诱导表达，经超滤纯化过程后并不能完全去除15，这不仅增加了蛋白纯化的难度，而且在食品中的应用带来了潜在的安全风险。酿酒酵母被认为是 GRAS（generallyrecognizedassafe）生物，作为表达体系研究历史悠久，已有多种血红蛋白在酿酒酵母中实现了异源表达1820，而目前关于酿酒酵母表达豆血红蛋白的研究鲜有报道。本研究对酿酒酵母异源表达豆血红蛋白进行了初步研究。将编码豆血红蛋白的 LBC2 的基因序列进行密码子优化，并在 N 端添加可以促

13、进真核生物基因翻译效率和提高基因表达水平的 kozak 序列2122，将优化序列连接在表达载体 pECS-TRP 上，通过对 TEF1、ADH1、GAP、GAL1,10 不同启动子的替换，确定启动子与 LBC2 基因的适配性，成功实现了豆血红蛋白在酿酒酵母中的表达，为酿酒酵母异源表达豆血红蛋白提供了理论和技术参考。1材料与方法1.1材料与仪器所涉及的菌株见表 1；表达克隆的基因见表 2；设计的引物信息见表 3；涉及的 LegH 序列经酿酒酵母密码子优化23（http:/www.jcat.de/）后交北京擎科生物科技有限公司合成；PCR 引物（见表 3）北京擎科生物技术公司合成；PrimeSTA

14、RMaxDNAPolymerase、LysisBufferforMicroorga-nismtoDirectPCR、DNA 限制性快切酶北京宝日医生物技术公司；GreenTaqMix南京诺维赞生物科技公司；T4DNA 连接酶、酵母基因组提取试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR 产物纯化试剂盒、胶回收试剂盒、酵母蛋白提取试剂盒、脱脂奶粉、SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、TBST、YNB、半乳糖、氨苄青霉素、咪唑及其他常用试剂上海生工生物工程公司；DNAmarker北京全式金生物技术公司；Anti-HisAntibody鼠单抗、超敏ECL化学发光液、快速转膜液、稳定性抗体稀释液、高效封闭液上海七纯生物

15、科技公司；HRP-山羊抗小鼠 IgG（H+I）二抗、GAPDHrabbitpAb、HRP-山羊抗兔 IgG（H+I）二抗苏州博奥龙科技公司；Western 一抗二抗去除液碧云天生物；HisSepNi-NTA6FFChromatographyColumn上海翌圣生物科技公司。ALLEGRAX-30R 型高速冷冻离心机美国贝克曼库尔特有限公司；HZQ-X300 型恒温培养振荡器上海一恒科学仪器有限公司；DYY-6C 电泳仪北京六一仪器厂；OmegaLumW 型化学发光多色荧光成像系统环亚生物科技公司；AH100D 型高压均质机安拓思纳米技术有限公司；SpectraMaxiD3型多功能酶标仪美谷分子

16、仪器有限公司。1.2实验方法1.2.1培养基的配制LB 培养基（g/L）：胰蛋白胨10，酵母提取物 5，氯化钠 10；pH7.07.4。根据实验需求添加 2%（w/v）琼脂粉。YPD 液体培养基（g/L）：蛋白胨 20，酵母提取物10，葡萄糖 20；根据实验需求添加 2%（w/v）琼脂粉。SC-Trp 筛选培养基（g/L）：葡萄糖 20，YNB5，硫酸铵 1.7。添加过滤除菌的 Leu、His、Ura 至终质量表1本研究涉及的菌株信息Table1Strainsusedinthisstudy菌株基因型来源E.coliDH5F-；80（lacZ）M15；（lacZYA-argF）U169；deoR

17、；recA1；endA1；hsdR17（rK-,mK+）;phoA；supE44-thi-1；gyrA96relA1TsingkeS.cerevisiaeCEN.PK2-1CMATaleu2-3,112；trp1-289；ura3-52；his31实验室保存表2本研究涉及的基因Table2Genesusedinthisstudy基因注释编号LegHCodinggeneoftheSoybean（Glycinemax）leghemoglobinNM_001248319.3TEF1pPromoterfortranslationelongationfactorEF-1alphaNM_001184177

18、.1ADH1pPromoterforalcoholdehydrogenase1NM_001183340.1GAPpPromoterforglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenaseNM_001179829.3表3本研究设计的引物Table3Primersdesignedinthisstudy引物序列（5-3）S-LegH-FCGGGATCCGCCACCATGGGTGCTTTCACTGAAAAGCS-LegH-RCGGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGAAADH1-EcoRI-FCCGAATTCCAACTTCTTTTCTTTTTTTTTCTT

19、TTCTCTCADH1-BamHI-RCGGGATCCAGTTGATTGTATGCTTGGTATAGCGAP-EcoRI-FCCGAATTCTCATTATCAATACTGCCATTTCAAAGAGAP-BamHI-RCGGGATCCTTTGTTTGTTTATGTGTGTTTATTCGTEF1-EcoRI-FCCGAATTCCCACACACCATAGCTTCAAAATEF1-BamHI-RCGGGATCCCTTAGATTAGATTGCTATGCTTTCTTTCpECS-TRP-EcoRI-RCGGAATTCCGCTCCAATTCAGCTGGC102食品工业科技2023 年10月浓度为 50g/m

20、L。1.2.2LegH 重组表达载体构建针对酿酒酵母对大豆血红蛋白 LBC2 基因序列进行密码子优化，并在N 端添加 kozak 序列以增强基因的翻译效率，在 C端添加 6His 标签用于后续蛋白分离纯化。通过在LegH 序列上下游分别添加 BamH和 Sal酶切位点，将其插入 pESC-TRP 质粒中，获得诱导型 pESC-TRP-GAL1,10-LegH 重组表达载体。通过设计引物S-LegH-F、pECS-TRP-EcoRI-R 对质粒 pESC-TRP-GAL1,10-LegH 进行 PCR 扩增获得不含启动子序列的质粒框架 pESC-TRP-LegH。对 S.cerevisiaeCE

21、N.PK2-1C 进行基因组提取并扩增获得组成型启动子ADH1，GAP，TEF1 序列，并在其两端分别添加 EcoR和 BamH酶切位点，通过 EcoR和 BamH酶切，将 pESC-TRP-LegH 与三种组成型启动子 ADH1，GAP，TEF1 通过 T4 连接酶酶连，连接产物转化入E.coliDH5 感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的LB 固体平板上，对阳性转化子进行菌落 PCR 筛选，提取质粒并送擎科测序验证。获得含有不同启动子的重组表达载体 pESC-TRP-GAL1,10-LegH、pESC-BamH、Sal I 酶切线性化T4 DNA 连接酶 酶连EcoR、BamH I 酶切线性

22、化T4 DNA 连接酶 酶连S-LegH-F、PES-TRP-EcoRI-RPCR扩增骨架PES-TRP-LegHpTEF1pADH1pGAPS.cerevisiae CEN.PK2-1C 基因组DNA图1重组表达载体构建流程图Fig.1Schematicdiagramoftherecombinantexpressionvectorconstructionprocess第44卷第20期薛常鲁，等：豆血红蛋白在酿酒酵母中的异源表达103TRP-TEF1-LegH、pESC-TRP-ADH1-LegH、pESC-TRP-GAP-LegH，重组示意图如图 1 所示。1.2.3酿酒酵母转化及重组菌发酵

23、根据酿酒酵母遗传学方法实验指南24中酵母感受态细胞制备和高效转化方法，将重组表达质粒转化入 S.cerevisiaeCEN.PK2-1C 中，涂布于 SD-TRP 营养缺陷型筛选培养基，获得转化子。将转化子通过 LysisBufferforMicroorganismtoDirectPCR（Takara）裂解后进行菌落 PCR 筛选检验。将验证后的阳性转化子接种于 SD-TRP 液体培养 基，30，220r/min 培 养24h。接 种1107CFU/mL 的菌体细胞于 YPD 培养基中发酵并额外添加 10g/mL的豆血红蛋白辅基血红素，诱导型表达菌株发酵 20h后补充诱导剂半乳糖至终浓度 2%

24、，30，220r/min总共发酵 48h。发酵液于 4，8000r/min 下离心10min 收集菌体，并用 PBS 缓冲液清洗菌体 2 遍去除培养基及血红素残留。通过高压均质机对酿酒酵母进行细胞破碎，4，11000r/min 离心 20min，取上清获得胞内蛋白样品，添加 PMSF 至终浓度1mmol/L，4 保存备用。1.2.4Westernblot 检测 LegH 表达水平采用生工酵母蛋白提取试剂盒对发酵 48h 菌液进行总蛋白提取。取 8L 抽提液进行 SDS-PAGE 分析，分离胶按照 15%进行配制将蛋白转至 PVDF 膜，快速封闭液封闭 1h，1:10000 稀释 Anti-Hi

25、sAntibody 鼠单抗 4低温摇床封闭过夜，TBST 漂洗三次后 1:5000 稀释HRP-山羊抗小鼠 IgG（H+I）二抗室温孵育 1h，超敏ECL 化学发光处理 10min，送化学发光成像检测。Western 一抗二抗去除液处理 10min，去除 his 抗体及其二抗。选择酵母 GAPDH 蛋白作为内参蛋白，采取与 his 抗体相同方法孵育内参抗体，1:10000 稀释 GAPDH rabbit pAb（Yeast）一抗，1:5000 稀释HRP-山羊抗兔 IgG（H+I）二抗。对检测结果进行ImageJ 数据处理。1.2.5LegH 蛋白纯化浓缩按照 10%（w/v）对菌体进行重悬，

26、130MPa 高压均质破碎细胞,11000r/min 离心 30min 获取上清液。通过 AKTApure 利用 HisSepNi-NTA6FF 纯化柱对蛋白进行纯化。纯化样品通过 15%SDS-PAGE 和全波段扫描进行蛋白定性分析。1.2.6蛋白浓度测定纯化样品适当稀释后通过Bradford 蛋白浓度测定法25测定总蛋白浓度，根据纯化样品 SDS-PAGE 图进行 ImageJ 灰度分析，计算 LegH 在总蛋白中所占百分比，从而算出豆血红蛋白浓度。2结果与分析2.1不同启动子 PCR 扩增产物鉴定通过对 S.cerevisiaeCEN.PK2-1C 基因组进行扩增获得三种不同启动子片段

27、TEF1（424bp）、ADH1（413bp）、GAP（683bp），经 1.5%琼脂糖凝胶电泳验证，如图 2 所示，片段大小符合目标条带大小。2.2重组表达载体鉴定及重组菌构建通过对重组转化大肠杆菌阳性克隆菌落 PCR 验证，提取阳性克隆重组质粒，EcoR和 Sal酶切验证表达框TEF1-LegH（882bp）、ADH1-LegH（871bp）、GAP-LegH（1141bp）、GAL1，10-LegH（1146bp），经 1.5%琼脂糖凝胶电泳，结果如图 3 所示。(bp)5000300020001000750500250100M12345M图3不同启动子重组质粒酶切电泳图Fig.3Ele

28、ctrophoresisplotofrecombinantplasmiddigestionatdifferentpromoters注：M：DNAmarker；1：PESC-TRP；2：PESC-TRP-TEF1-LegH；3：PESC-TRP-ADH1-LegH；4：PESC-TRP-GAP-LegH；5：PESC-TRP-GAL1、10-LegH。由图 3 可见，重组表达载体成功转入大肠杆菌，片段大小符合目标条带大小。重组质粒送北京擎科生物科技有限公司测序，测序结果与设计序列一致，表明含不同启动子的 LegH 表达质粒构建成功。将鉴定正确的重组表达载体转入酿酒酵母感受态细胞中，转化子通过菌落

29、 PCR 验证，成功获得相应重组酿酒酵母表达菌株。(bp)5000300020001000750500250100M123图2启动子片段 PCR 产物电泳图Fig.2ElectrophoresisplotofthePCRproductsofthepromoterfragments注：M：DNAmarker；1：TEF1；2：ADH1；3：GAP。104食品工业科技2023 年10月2.3Westernblot 检测不同启动子 LegH 表达水平启动子的选择在基因转录起始过程中起到重要的调控作用，选择合适的启动子与外源基因适配对基因的高效表达十分重要。酿酒酵母表达系统常用的启动子主要分为诱导型启

30、动子和组成型启动子两种。组成型启动子在启动转录起始时无需转录因子的参与，可以维持一定的基因转录水平，而诱导型启动子则受调控基因严格调控，基因表达需要添加特定诱导剂进行诱导表达26。根据表达需求选择合适的启动子对于外源基因的表达至关重要。本研究中选择酿酒酵母中较为常见的三种组成型强启动子（TEF1、ADH1、GAP）和诱导型强启动子 GAL1,10分别表达 LegH 并进行比较，通过 Westernblot 验证 LegH 蛋白表达情况，结果见图 4 和图 5。12345GAPDH37 kDa16 kDaLegH图4Westernblot检测 LegH 表达Fig.4Westernblotana

31、lysisofLegHexpression注：1：PESC-TRP-TEF1-LegH；2：PESC-TRP-ADH1-LegH；3：PESC-TRP-GAP-LegH；4：PESC-TRP-GAL1、10-LegH；5：S.cerevisiaeCEN.PK2-1C 未转入质粒菌株。TEF1ADH1GAPGAL1,10012345相对光密度*图5不同启动子下 LegH 表达水平灰度分析Fig.5GrayscaleanalysisofLegHexpressionlevelsatdifferentpromoters注：*表示与启动子 TEF1 相比，启动子 ADH1、GAP 在对LegH 表达时具

32、有显著性优势，P0.01；*表示与启动子GAL1,10 相比，启动子 TEF1、ADH1、GAP 在对 LegH 表达时具有显著性优势，PGAPpADH1p，这与 Sun 等27的研究结果一致。诱导型启动子在表达蛋白所展示出的优势也与邱玲等28在酿酒酵母中表达乙肝抗原时相同，但其组成型启动子相对强度结果显示 ADH1pTEF1p。因此，需要根据表达蛋白的不同进行启动子的优化选择，以调整转录强度进而提升目标物质的产量。2.4LegH 表达结果对重组酵母菌株在发酵培养基中进行发酵，在不同发酵时间测定菌体密度，以 SDS-PAGE 蛋白电泳检测目标蛋白表达情况，结果如图 6 和图 7 所示。由图 6

33、 中可以看出，菌体在 1236h 菌体大量扩增，处于指数增长期，48h 后细胞增长速率缓慢，菌体密度趋于稳定。图 7 中发酵液 SDS-PAGE 蛋白电泳结果显示，随着发酵时间的增加，LegH 的表达量呈上升趋势，在发酵 48h 时表达量达到最高，随着发酵时间延长，LegH 表达量没有明显提升，甚至有所降解，因此确定最佳发酵时间为 48h。生长曲线OD6002.52.01.51.00.50.0发酵时间(h)01224364860728496图6重组酵母生长曲线Fig.6RecombinantyeastgrowthcurvekDa503831251610LegHM24 h 32 h 40 h 4

34、8 h 56 h 64 h 72h 80 h图7SDS-PAGE电泳检测不同发酵时间LegH表达量Fig.7LegHexpressionatdifferentfermentationtimedeterminedbySDS-PAGEelectrophoresis第44卷第20期薛常鲁，等：豆血红蛋白在酿酒酵母中的异源表达105因蛋白表达量较低，SDS-PAGE 电泳显示杂蛋白条带较多，直接对蛋白定量不准确，因此对发酵 48h的蛋白进行了浓缩纯化以更好地定量。在进行重组质粒设计时 LegH 碳末端加有 His纯化标签，因此可以通过镍柱对 LegH 进行亲和层析。在咪唑洗脱浓度为 250mmol/L

35、 的条件下获得了目标蛋白，蛋白经 15%SDS-PAGE 电泳验证，在目标区域出现明显条带，如图 8 所示。蛋白经全波段光谱扫描显示，在 420nm 波长下有特征吸收峰，如图 9 所示，符合血红素辅基卟啉化合物的特征吸收2930。蛋白分子量与通过氨基酸序列预测的一致，表明豆血红蛋白在酿酒酵母中成功表达。通过Bradford 法测定蛋白浓度结合灰度分析，测得蛋白浓度达到 698.33mg/L，折算成发酵浓度为 2.79mg/L。该表达水平与现有报道的毕赤酵母菌株相比8，尚有一定差距。但该水平仅是目前的初步研究结果，尚未进行发酵工艺优化，后续通过发酵优化以及相关代谢途径的强化（添加信号肽进行分泌型

36、表达、构建血红素合成途径等），有望进一步提升菌株的表达水平。(kDa)503831251610LegHM图8纯化蛋白 SDS-PAGE 电泳图Fig.8SDS-PAGEelectrophoresisplotofpurifiedlegH3003504004505005506000.00.10.20.30.40.50.60.70.80.9OD波长(nm)图9LegH 蛋白光谱分析Fig.9SpectrophotometryanalysisofLegH3结论本研究成功构建了豆血红蛋白酿酒酵母异源表达菌株，在不同启动子下实现了 LegH 的表达，其中诱导型启动子 GAL1,10 获得了较高表达水平，蛋

37、白经镍柱浓缩纯化后，测得 LegH 浓度达到 698.33mg/L，折算成发酵浓度为 2.79mg/L。酿酒酵母作为一种GRAS 生物，其在食品工业中应用的安全性是无法比拟的，经过深入研究，酿酒酵母有可能成为豆血红蛋白异源表达的又一途径。参考文献1JINY,HEXY,ANDOH-KUMIK,etal.EvaluatingpotentialrisksoffoodallergyandtoxicityofsoyleghemoglobinexpressedinPichia pastorisJ.MolecularNutrition&FoodResearch，2018，62（1）：13.2 APPLEBY

38、 C A.Leghemoglobin and rhizobium respirationJ.AnnualReviewofPlantPhysiology，1984，35（1）：443478.3HARGROVEMS,BARRYJK,BRUCKEREA,etal.Char-acterizationofrecombinantsoybeanleghemoglobinaandapolardis-tal histidine mutantsJ.Journal of Molecular Biology，1997，266（5）：10321042.4SIMSAR,YUENJ,STOUTA,etal.Extracel

39、lularhemepro-teinsinfluencebovinemyosatellitecellproliferationandthecolorofcell-basedmeatJ.Foods，2019，8（10）：521.5FRASERRZ,SHITUTM,AGRAWALP,etal.Safetyevalu-ationofsoyleghemoglobinproteinpreparationderivedfromPichiapastoris,intendedforuseasaflavorcatalystinplant-basedmeatJ.InternationalJournalofToxic

40、ology，2018，37（3）：241262.6周景文,张国强,赵鑫锐,等.未来食品的发展：植物蛋白肉与细 胞 培 养 肉 J.食 品 与 生 物 技 术 学 报，2020，39（10）：18.ZHOUZW,ZHANGGQ,ZHAOXR,etal.Futureoffood:plant-basedandcell-culturedmeatJ.JournalofFoodScienceandTechnology，2020，39（10）：18.7陈林杰,薛常鲁,苏悦,等.豆血红蛋白在毕赤酵母中的表达条件优化J.微生物学通报，2022，49（6）：20502061.CHENLJ,XUECL,SUY,et

41、al.OptimizationofleghemoglobinexpressionconditionsinPichia pastorisJ.MicrobiologyChina，2022，49（6）：20502061.8SHAOYR,XUECL,LIUWJ,etal.High-levelsecretoryproductionofleghemoglobininPichia pastoristhroughenhancedglobinexpressionandhemebiosynthesisJ.BioresourceTechnolo-gy，2022，363：127884.9ARREDONDO-PETER

42、R,MORANJF,SARATHG,etal.MolecularcloningofthecowpealeghemoglobinIIgeneandexpres-sionofitscDNAinEscherichia coli(purificationandcharacteriza-tionoftherecombinantprotein)J.PlantPhysiology，1997，114（2）：493500.10LIULF,MARTINEZJL,LIUZH,etal.Balancedglobinproteinexpressionandhemebiosynthesisimproveproductio

43、nofhu-manhemoglobininSaccharomyces cerevisiaeJ.MetabolicEngi-neering，2014，21：916.11ZHANGBH,ZHAOXR,WANGZW,etal.Efficientse-cretoryexpression and purification of food-grade porcine myo-globininKomagataella phaffiiJ.JournalofAgriculturalandFoodChemistry，2021，69（35）：1023510245.12ZHAOXR,ZHOUJW,DUGC,etal.

44、RecentadvancesinthemicrobialsynthesisofhemoglobinJ.TrendsinBiotechnology，2021，39（3）：286297.13SUMANSP,JOSEPHP.MyoglobinchemistryandmeatcolorJ.AnnualReviewofFoodScienceandTechnology，2013，4（1）：7999.14FRASERR,BROWNPO,KARRJ,etal.ImpossibleFoodsInc.Methodsandcompositionsforaffectingtheflavorandaromaprofil

45、eofconsumables:US,9700067B2P.20170711.15SHANKARS,HOYTMA.ImpossibleFoodInc.Expres-sionconstruction and methods of genetically engineering methy-106食品工业科技2023 年10月lotrophicyeast:US,WO2016/183163A1P.20180119.16苏悦.微生物高效表达异源豆血红蛋白的研究D.杭州:浙江大学,2020.SUY.Studyonefficientexpressionofheterolo-gous leghemoglobi

46、n in microorganismsD.Hangzhou:ZhejiangUniversity,2020.17CURRELLDL,LEVINJ.Theoxidativeeffectofbacteriallipopolysaccharideonnativeandcross-linkedhumanhemoglobinasafunctionofthestructureofthelipopolysaccharideJ.FebsJour-nal，2010，269（18）：46354640.18MARTINEZJL,LIULF,PETRANOVICD,etal.Engi-neeringtheoxygen

47、sensingregulationresultsinanenhancedrecom-binant human hemoglobin production by Saccharomyces cerevi-siaeJ.BiotechnologyandBioengineering，2015，112（1）：181188.19MOULDRM,HOFMANNOM,BRITTAINT.Productionofhumanembryonichaemoglobin(GowerII)inayeastexpressionsystemJ.BiochemicalJournal，1994，298（3）：619622.20

48、BUISSONN,LABBE-BOIS R.Flavohemoglobin expres-sionandfunctioninSaccharomyces cerevisiae:NorelationshipwithrespirationandcomplexresponsetooxidativestressJ.JournalofBiologicalChemistry，1998，273（16）：9527.21OUTTENCE,CULOTTAVC.AlternativestartsitesintheSaccharomyces cerevisiae GLR1geneareresponsibleformit

49、ochon-drialandcytosolicisoformsofglutathionereductaseJ.TheJour-nalofBiologicalChemistry，2004，279（9）：77857791.22STUARTJA,HARPERJA,BRINDLEKM,etal.Physio-logicallevelsofmammalianuncouplingprotein2donotuncoupleyeastmitochondriaJ.TheJournalofBiologicalChemistry，2001，276（21）：186339.23GROTEA,HILLERK,SCHEER

50、M,etal.JCat:Anoveltoolto adapt codon usage of a target gene to its potential expressionhostJ.NucleicAcidsResearch,2005,33(WebServerissue):W526.24安伯格.酵母遗传学方法实验指南M.第二版.北京:科学出版社,2009:98.ANBERGDC.MethodsinyeastgeneticsM.Secondedition.Beijing:SciencePress,2019:98.25JINQ,PANF,HUCF,etal.Secretoryproduction