1、论著 收稿日期:作者单位:嘉兴市妇幼保健院药剂科浙江 嘉兴 上海交通大学医学院附属新华医院药学部上海 海军军医大学附属长海医院药学部上海 基金项目:浙江省医药卫生科技计划项目()通信作者 :./.负载自噬抑制小干扰 的聚精氨酸多肽纳米胶束抗肿瘤转移作用的初步研究胡楚玲顾芬芬宫春爱夏清明 摘 要 目的制备一种负载 的阿霉素聚精氨酸多肽纳米胶束考察其对前列腺癌细胞的体外抗肿瘤转移能力并探索其可能的作用机制方法采用多肽固相合成法合成聚精氨酸组氨酸()再与阿霉素衍生物()通过缩合反应合成 产物与 半胱氨酸反应并纯化得到 与 共孵育形成聚合物胶束 通过透射电镜观察形态动态光散射法测定其粒径和电位同时考察
2、其稳定性在人前列腺癌细胞株 细胞中采用流式细胞术考察细胞摄取情况采用 法检测 抗细胞增殖能力采用荧光显微镜观察 染色自噬小体的生成采用 法观察、及 蛋白的表达采用 法观察纳米胶束抗细胞侵袭能力结果制备的聚精氨酸多肽胶束()粒径大小合适平均粒径为()电位为()形态分布均匀 放置 后稳定性良好 流式细胞结果表明 具有较好的细胞摄取能力 结果显示 具有较强的细胞毒性 此外 染色法及 结果显示 可显著抑制阿霉素()引起的细胞自噬 抗细胞侵袭试验表明 具有较强的抗肿瘤转移能力可能与抑制 蛋白的表达有关结论负载 的阿霉素聚精氨酸多肽纳米胶束具有较强的抗肿瘤转移能力具有良好的临床应用前景关键词 前列腺癌自噬
3、阿霉素抗转移 ().()().()()().:引言前列腺癌已成为危害男性健康的重要肿瘤之一激素抵抗是晚期前列腺癌治疗的难题 以多西他赛为基础的联合治疗是内分泌治疗失败后前列腺癌的一线化疗方法但存在化疗耐药的问实用药物与临床 年第 卷第 期 .题 目前前列腺癌化疗耐药可能与前列腺癌细胞内自噬活性的异常升高有关细胞自噬是一种细胞自我降解的过程在适应代谢应激、保持基因组完整性及维持内环境稳定方面发挥重要作用 在肿瘤治疗中凋亡耐受是产生肿瘤耐药的重要机制细胞自噬可抵抗抗肿瘤药物诱导的凋亡促进肿瘤耐药 因此抑制细胞自噬可能是逆转肿瘤细胞耐药的关键 基因也称 基因是酵母 的同系物也是哺乳动物参与自噬的特异
4、性基因 基因主要通过与 型 形成复合体来调节其他 蛋白在自噬前体结构中定位调节自噬活性 上调 在哺乳动物中的表达能够刺激自噬的产生 研究发现的卵巢癌、乳腺癌及前列腺癌中存在 基因的缺失性突变 因此自噬抑制可作为提高化疗疗效的重要辅助策略 采用 技术()下调 的表达通过靶向型 通路抑制前列腺癌细胞的自噬活性可提高其对化疗药物多西他赛()的敏感性进一步表明 可作为一种治疗前列腺癌的新方法 因此如果将 与化疗药物共同递送到肿瘤组织则可提高晚期前列腺癌细胞对多西他赛等化疗药物的敏感性 基于此本研究在聚精氨酸组氨酸()的组氨酸末端氨基上修饰 并通过半胱氨酸分子内交联形成大分子载体与 共孵育形成共载胶束(
5、)同时选择人前列腺癌细胞系 细胞作为实验对象探讨其体外抗肿瘤转移作用旨在寻找一种靶向效率高、生物相容性好、毒性低的纳米载体 材料和方法 主要仪器和试剂 粒度测定仪(公司英国)透射电镜(公司日本)精氨酸盐酸盐、精氨酸和生工生物工程(上海)股份有限公司中国(美国)试剂盒(美国)、/、抗体及二抗(英国)培养基、胎牛血清(公司美国)其他试剂均为分析纯 细胞系及细胞培养人前列腺癌细胞系细胞(购自中科院上海细胞所)将 青霉素/链霉素于、孵箱中培养 细胞培养严格按照细胞培养规程及无菌条件操作 的制备及表征 首先在芴甲氧羰基保护的前提下采用固相合成法合成聚精氨酸组氨酸()多肽并通过反相高效液相色谱法进行纯化
6、接着阿霉素衍生物()与 肽 末 端 羧 基 通 过 缩 合 反 应 得 到()产品通过反相高效液相色谱法纯化 然后()和 半胱氨酸盐酸盐 溶于 ()蒸馏水随后向混合溶液中滴加 过氧化氢溶液并搅拌此后避光孵育 反应物装入透析袋(截留分子量 )在蒸馏水中室温下透析 将透析后的产物冷冻干燥 以获得纯化的 将获得的 与 共孵育 得到 采用粒径分析仪测定 的粒径、电位 将制备的 置于 条件下分别于第、小时肉眼观察外观形状并考察其粒径、电位变化以评价稳定性 纳米胶束的体外细胞学评价 流式细胞术考察细胞摄取能力采用流式细胞术考察纳米胶束在人前列腺癌细胞 的摄取能力 将处于对数生长期的 细胞按 个/孔接种到
7、孔板置于 、孵箱中培养 采用 荧光标记的 和 纳米胶束按照/、的比例混合涡旋 避光孵育 制备荧光素标记的 培养后更换为无血清培养基之后每孔加入不同浓度的、(为 、/)和不同/的 继续培养 用 将细胞清洗 次胰酶消化离心后 重悬 采用流式细胞仪考察细胞对纳米胶束的摄取情况 法考察纳米胶束的细胞毒性采用 法对 纳米胶束的细胞毒性进行考察 将处于对数生长期的人前列腺癌细胞按 个/孔接种到 孔板中置于、孵箱中培养 弃去培养基之后每孔加入不同浓度的 纳米胶束(为 、/)继续培养、吸掉培养基更换为含 的新鲜培养基继续孵育 酶标仪 测定 值 以未处理细胞为对照未接种细胞的孔为空白孔计算每孔的细胞活力由于 体
8、内易被酶降解因此采用转染试剂 ()保护 实用药物与临床 年第 卷第 期 .将 与 共同孵育以制备 组 将新鲜配置的、(/)分别加入至培养孔中继续培养 通过显微镜观察不同处理后 细胞的形态学变化 法染色观察细胞自噬情况接种 个 细胞于预先加入盖玻片的 孔板中继续培养 将 与 共同孵育以制备 组 将新鲜配置的、(/)分别加入至培养孔中继续培养 用 洗涤 次加入 染液室温避光染色 用 洗涤 次滴加 抗猝灭封片液封片后置于 避光保存置于荧光显微镜下观察细胞自噬情况 蛋白免疫印迹试验采用蛋白免疫印迹试验考察纳米胶束对细胞自噬的影响 将处于对数生长期的人前列腺癌细胞 以每孔 个细胞的密度接种于 孔板中孵育
9、 将新鲜配置的、(/)分别加入至培养孔中继续培养 收集细胞用 裂解缓冲液重悬冰上孵育 然后收集蛋白质样本 等量的蛋白通过煮沸 变性分离转移到 膜(美国)上用 脱脂奶粉在室温下阻断 然后用抗体、检测 纳米胶束抗侵袭作用研究采用 法考察纳米胶束抗细胞侵袭能力 在 过夜融化用 预冷的无血清培养基稀释 至终浓度 /冰上操作在 上室底部中央垂直加入 稀释后的 孵育 使 凝成固体将预先经、(/)处理的细胞按 个加入到小室中下室加入含 的培养基 继续培养 孵育结束后小心取出细胞小室洗掉小室上层培养液 清洗一遍 多聚甲醛固定 结晶紫染色 清洗 次立即用棉签擦去上层的细胞静置风干显微镜下观察滤膜下层的细胞 统计
10、学方法 应用 软件进行统计学分析 数据以 表示组间比较采用方差分析()检验水准 结果 纳米胶束的合成与表征粒径、电位是纳米胶束基本的考察指标 如图 所示 的粒径为()图 中的 透射电镜图显示纳米胶束呈球形分布大小均匀粒径在 左右与粒径仪测得的粒径相一致 图 为 的电位图电位为()表明 具有较好的分散性 图 为 的稳定性考察结果结果显示 在 内平均粒径和电位无明显变化 后的平均粒径和电位略有增大可能是由于随着时间的推移部分纳米胶束出现凝聚现象图 的粒径电位图和稳定性实验结果注:的粒径和透射电镜图 的电位图 的稳定性实验结果 与 粒径比较 与 电位比较 纳米胶束的摄取通过流式细胞术检测纳米胶束的细
11、胞摄取能力 如图 所示 细胞对 的摄取呈剂量依赖性 当 浓度为、/时 阳性细胞分别占、和 然而 的细胞摄取在 低浓度时即有较高的摄取 当 浓度为 /时 阳性细胞率明显高于 的阳性细胞率()采用 探针标记 通过流式细胞术定量分析 的细胞摄取情况 如图 所示 荧光信号随/比值的增大而增大当/为 时 阳性细胞分实用药物与临床 年第 卷第 期 .别是/和/的 倍和 倍()显著高于 组 这些结果表明经细胞膜穿透肽修饰的 更容易进入细胞其中 在/为 时表现出最佳的吸收效率图 细胞对 和 的流式细胞摄取能力注:不同 浓度下 细胞对 的阳性摄取率 不同/条件下 的阳性细胞率 考察纳米胶束的细胞毒性图、分别表示
12、用不同浓度 和 处理 和 后 细胞的存活率 结果表明培养 后游离 对 细胞的 值为 /的 值低于游离(/)差异有统计学意义 结果表明与 共递送可显著增强阿霉素的细胞毒性图 不同 浓度下 和 对 细胞的杀伤能力注:显微镜观察结果显示对照组细胞密度均匀生长状态良好无坏死脱落 和 处理后细胞形态无明显变化单纯 处理可见部分细胞皱缩变圆该现象在 组最为明显脱落和死亡的细胞明显增多 见图图 显微镜观察不同处理组作用 后的 细胞形态()实用药物与临床 年第 卷第 期 .荧光显微镜观察 染色自噬小体 不同药物组作用 后的 染色结果如图 所示由图中可见 单药组荧光最强 组次之 组最弱表明化疗药物可以刺激肿瘤细
13、胞产生自噬共载了 和 的纳米胶束()组成功在细胞内产生了抑制自噬的作用 组较 组弱的原因可能与纳米胶束使化疗药物达到缓释效果有关图 染色法观察各组细胞自噬情况()、和 蛋白表达为了探讨 在调节阿霉素诱导自噬中的作用采用 检测、和 的表达水平 与对照组相比 处理诱导自噬标记蛋白 表达显著升 高 蛋 白 表 达 显 著 降 低(图)此外/在 组表达较弱 在 中积累表明 可诱导 细胞自噬包裹 纳米颗粒可降低自噬发生率 从图 可以看出 在 组的表达水平最低可能与 抑制细胞自噬有关 抗细胞侵袭能力 抗细胞侵袭能力结果如图 所示 对照组细胞侵袭能力最强 组具有较强的侵袭能力 组侵袭能力明显降低图 法检测各
14、组、的表达水平图 法检测各组 的表达水平图 显微镜观察各处理组细胞侵袭情况()讨论本研究在前期构建了共载 和 的聚精氨酸多肽胶束抗肿瘤活性的基础上对其抗肿瘤转移的作用进行了初步研究旨在通过联合给药提高对转移性肿瘤的疗效 首先制备的多肽纳米胶束具有较为合适的粒径粒径大小均匀可充分利用肿瘤的增强渗透滞留效应()使药物富集于靶区 在细胞摄取方面 组在 浓度较低时就能达到较高的细胞摄取表明纳米胶束包裹后增强了与细胞膜的亲和力从而达到有实用药物与临床 年第 卷第 期 .效运输和高效释放的目的细胞毒性结果显示随着药物浓度的增加各给药组的细胞毒性也相应增加表明 药物具有剂 量 依 赖 性 的 特 征 在 相
15、 同 药 物 浓 度 下 的细胞毒性强于 表明 可以通过共载化疗药物 和基因药物 实现抗肿瘤细胞增殖的作用通过 染色法和 法对、蛋白的表达进行检测结果表明 组导致 细胞内 及/表达升高可以初步推测 诱导细胞过度自噬胞内自噬体急剧增多 而 组由于 发挥抑制自噬作用后抵抗了 引起的自噬从而使 及/的表达下降 的表达也验证了这一现象纳米多肽胶束抗细胞转移能力可从抗细胞侵袭试验及 的表达得到初步结论 作为一种接头蛋白能将信号从细胞外经整合素途径向细胞内传递是细胞骨架与胞外基质连接不可缺少的交通纽带在细胞黏附和迁移过程中起着关键作用与肿瘤细胞转移的关系十分密切 细胞侵袭试验结果显示给药后各组细胞的侵袭能力下降 组侵袭能力最弱表明 具有较好的抗细胞侵袭能力 此外经过 和 共处理后细胞自噬能力下降 的表达下降符合其作用原理 本研究表明 作为化疗基因治疗联合制剂具有较好的抗肿瘤转移能力后期可进一步开展其抗肿瘤转移的机制研究参考文献:.():.:.():.():.():.:.():.:.():.():.:.():.:.():.():.():.():.():.:./.():.():.():.():.():.:.:.().:.()/.():.:.():.():.():.(本文编辑:高宽)实用药物与临床 年第 卷第 期 .
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