复合除油微生物菌剂的油脂去除特性.pdf

1、31食品与生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第8 期研究论文复合除油微生物菌剂的油脂去除特性凌玲1.2.3，李秀芬*1,2.3（1.江南大学环境科学与工程学院，江苏无锡2 1412 2；2.江苏省厌氧生物技术重点实验室，江苏无锡2 1412 2；3.江苏省水处理技术与材料协同创新中心，江苏苏州2 15 0 0 9）摘要：为扩大油脂降解的菌种库资源，提高餐厨垃圾中油脂的生物转化效率，作者以所在实验室自行保藏的4株微生物菌株为油脂降解菌，通过等比例复配获得研究用复合除油微生物菌剂，研究了影响菌剂除油效果的因素及组成菌株产脂肪酶的能力。结果表明，复合除油微生物菌剂在温度为2 5 5 5、pH为4

2、 9、盐质量浓度为5 9 0 g/L、油脂体积分数1%5%、接种体积分数1%9%时，均具有一定的除油能力，除油率最高可达8 4.7 5%。单一菌株实验结果表明，菌株B501所产脂肪酶的酶活最高，而菌株0 0 9 所产脂肪酶处于高酶活的持续时间较长，因此除油能力也最强。此外，复合菌剂的除油效果优于单一菌株。关键词：餐厨垃圾；复合除油菌剂；油脂降解；脂肪酶酶活中图分类号：X172文章编号：16 7 3-16 8 9(2 0 2 3)0 8-0 0 31-0 7 DOl：10.39 6 9/j.i s s n.16 7 3-16 8 9.2 0 2 3.0 8.0 0 4Study on the G

3、rease Removal Characteristics ofthe Compound Degreasing Microbial AgentLING Lingl.2.3,LI Xiufenl.2.3(1.School of Environmental Science and Engineering,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.KeyLaboratory of Anaerobic Biotechnology of Jiangsu Province,Wuxi 214122,China;3.Jiangsu Water TreatmentTechn

4、ology and Material Collaborative Innovation Center,Suzhou 215009,China)Abstract:To expand the strain pool of oil degradation and to improve the biotransformationefficiency of oil in food waste,4 microbial strains preserved in the laboratory were used as lipasedegrading bacteria,the compound oil-remo

5、ving microbial agent was obtained by equal proportionmixture of the 4 strains.The factors affecting oil removal and lipase production ability of thedifferent strains were investigated.The results showed that the compound oil-removing microbialagent had oil-removing ability at temperature 2555,p H 4

6、9,s a l t c o n t e n t 5-9 0 g/L,o i lconcentration 1%5%,inoculum 1%9%,and the degradation rate of oil can reach up to 84.75%.The results of the single strain experiments showed that the strain B501 had the highest lipaseactivity,while strain 009 had the strongest oil removal ability because of its

7、 longer duration of highlipase activity.Also,the oil removal effect of compound bacteria is better than that of a single strain.Keywords:food waste,compound degreasing bacteria agent,oil degradation,lipase enzyme activity收稿日期：2 0 2 1-0 5-18基金项目：国家“十三五 重点研发计划项目（2 0 16 YFC0400707）；江苏省“六大人才高峰 项目（2 0 11

8、-JNHB-004）。*通信作者：李秀芬（19 6 8 一），女，博士，教授，博士研究生导师，主要从事水处理、固废资源化研究。E-mail：x f l i j i a n g n a n.e d u.c n32JOURNAL OFFOOD SCIENCEANDBIOTEIOLOGYVol.42lssue82023乳化油脂能力和油脂去除率的影响NaCl质量浓度对模拟废水的OD600、菌体质量浓度NaCl质量浓度分别至10、30、5 0、7 0、9 0 g/L，研究调整三角瓶中至装有10 0 mL模拟含油废水的影响取体积分数5%的上述复合除油菌剂，投加Compound Degreasing Mic

9、robialAgentLINGLing,etal:StudyontheGreaseRemovalCharacteristicssoftheEARCHICL随着我国国民经济的快速发展及人们对美好生活的追求，餐饮业规模不断扩大，同时，餐厨垃圾的产生量也以每年10%的速度持续增长。餐厨垃圾含有高浓度的有机质、油脂和盐，且含水率较高，若不及时处理，易腐败酸化，滋生蚊蝇，污染周边环境。目前，餐厨垃圾的处理以生物方法为主，主要包括厌氧消化和好氧堆肥两种。与好氧堆肥技术相比，餐厨垃圾厌氧消化的周期较长、启动较慢、卫生环境条件较差，且会产生大量温室气体，因此餐厨垃圾好氧堆肥处理近年来引起了研究人员的广泛关注。

10、好氧堆肥过程不仅可消除餐厨垃圾带来的环境污染，所得堆肥产物还可用作土壤有机肥，实现餐厨垃圾的无害化、资源化和减量化，同时还能减少处理过程中的碳排放，有利于固体废物处理向碳中和模式演变，有助于生态文明建设，具有较为重要的现实意义。油脂是餐厨垃圾的主要组成成分之一，在好氧堆肥过程中较难降解/转化，添加微生物菌剂可大大提高其转化效果，有利于提高堆肥产品的腐熟度及品质。有研究人员在2 5 条件下，从皮革废水中筛选得到了4株油脂降解菌，将其固定化后，该菌剂最高除油率可达8 6.1%4。王亚军等将铜绿假单胞菌以体积分数6%接种到含油脂3g/L的培养基中，30条件下培养3d，发现油脂去除率达到55.37%5

11、。卢永昌等发现，莴苣不动杆菌对体积分数2%花生油的去除率可达9 5.7%，此后，随着油脂质量浓度的升高，油脂降解率降低。Awasthi等将短芽芽孢杆菌、农业短杆菌、蜡状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌进行复配，其对油脂的去除率为6 5.47%7。肖翰等将黏至沙雷氏菌接种到病死猪堆肥的堆体中，发现接种体积分数1.0%和1.5%的效果优于0.5%，最终油脂体积分数可降低到15%8作者以所在实验室自行保藏的4个微生物菌株为油脂降解菌，通过等比例复配获得了所用复合除油微生物菌剂，研究了温度、pH、含盐量、油脂质量浓度及接种体积分数对除油菌生长及除油效果的影响，进一步研究了组成菌株产脂肪酶的能力，以期扩大油脂降解

12、的菌种库资源，提高餐厨垃圾或餐厨废水中油脂的生物转化效率。材料与方法1.1实验材料复合除油微生物菌剂的组成菌株：均为作者所在实验室保藏菌株，编号分别为0 0 5、0 0 9、B409和B501。其中菌株0 0 5 细胞呈杆状，革兰氏阳性，好氧或兼性厌氧，在营养肉汤培养基（LB）上的菌落呈淡黄色，表面光滑湿润凸起，边缘光滑，易挑起；菌株009细胞呈棒状，革兰氏阳性，产芽孢，兼性厌氧，在LB培养基上的菌落呈乳白色，表面粗糙扩展干燥，边缘假根状，不易挑取；菌株B409细胞呈棒状，革兰氏阳性，产芽孢，好氧，菌落呈乳白色，半透明颗粒状，边缘整齐，表面光滑湿润；菌株B501细胞呈短杆状，革兰氏阳性，产芽孢

13、，好氧，菌落呈淡黄色，不透明，表面光滑湿润，边缘整齐，凸起，易挑起1.2实验方法将上述4个菌株分别接种至装有牛肉膏蛋白陈培养基的摇瓶中，pH7.0、30 和16 0 r/min的条件下振荡培养，每隔12 h测定一次ODso0，待OD6o0不再变化时，即分别获得4个菌株的种子液，将4个菌株的种子液按体积比1:1:1:1比例混合，即获得本研究用复合除油菌剂1.2.1温度对除油菌生长及油脂去除的影响取体积分数5%的上述复合除油菌剂，投加至装有100mL模拟含油废水的三角瓶中，在温度为2 5、35、45、5 5 的条件下，研究温度对模拟含油废水的OD600、菌体质量浓度、乳化油脂能力和油脂去除率的影响

14、。模拟含油废水的组成为：(NH4)SO42.0g，KH,P04 2.0 g,K,HPO4 2.0 g,MgSO4.7H,0 0.2 g,NaCl5.0g，酵母提取物1g，蒸馏水10 0 0 mL，大豆油101.2.2pH对除油菌生长及油脂去除的影响取体积分数5%的上述复合除油菌剂，投加至装有100mL模拟含油废水的三角瓶中，用0.1mol/L的HCl和NaOH调节pH分别至4、5、6、7、8、9，研究pH对模拟废水的ODo00、菌体质量浓度、乳化油脂能力和油脂去除率的影响1.2.3NaCl质量浓度对除油菌生长及油脂去除的1.2.4油脂质量浓度对除油菌生长及油脂去除的影响取体积分数5%上述复合除

15、油菌剂，投加至装有10 0 mL模拟含油废水的三角瓶中，用大豆油33食品与生物技术学报2023年第42 卷第8 期复合除油微生物菌剂的油脂去除特性凌玲，等：研究论文调整油脂质量浓度分别至10、2 0、30、40、5 0 g/L，研究油脂质量浓度对模拟废水的OD600、菌体质量浓度、乳化油脂能力和油脂去除率的影响接种体积分数对除油菌生长及油脂去除的影响取体积分数分别为1%、3%5%、7%、9%的上述复合除油菌剂，接种至装有10 0 mL模拟含油废水的三角瓶中，研究菌剂接种体积分数对模拟废水的OD6o0、菌体质量浓度、乳化油脂能力和油脂去除率的影响。1.2.6配方菌株的产酶能力研究在上述最佳条件下

16、，研究配方菌株所产脂肪酶活性随处理时间的变化情况。1.3分析测试项目与方法1.3.1模拟废水的OD600测定含菌溶液在波长为600nm处的吸光度。1.3.2菌体质量浓度取两支无菌离心管，称质量后，加人一定体积的含菌溶液，8 0 0 0 r/min离心后，弃去上清液，再次称质量后，由式（1）计算菌体质量浓度p(g/L)：(m2-mi)x(1-w)(1)V式中：m为无菌管质量，mg;V为含菌溶液体积，mL;m为离心后无菌管质量，mg；w 为离心沉淀物的含水率，%。1.3.3乳化油脂能力取1mL含菌溶液加人大豆油质量分数为2%的发酵培养基中,30、16 0 r/min培养7 2 h后，在10 0 0

17、 0 r/min条件下离心15 min，取上清液1mL，加入磷酸钾缓冲液（pH7.0）5.2mL，与0.2 mL大豆油混合，振荡2 min后，静置10min，测5 40 nm处的吸光度，即得菌剂的乳化油脂能力。1.3.4除油率油脂质量浓度采用紫外分光光度法测定除油率Q（%）通过式（2）计算：Q=Po-PR100%(2)Po式中：po为初始油脂质量浓度，g/L；PR 为反应后油脂质量浓度，g/L。1.3.5脂肪酶的酶活采用脂肪酶制剂中的检测方法测定10)。脂肪酶催化脂肪水解，生成脂肪酸和甘油，由于生成的脂肪酸使酶反应液变酸，用NaOH标准溶液滴定，滴定至微红色保持30 s不褪色，记录NaOH消耗

18、体积。酶活E(/mL)由式(3)计算：E=(V-V)XPNoix50 xD,(3)0.0515式中：V为NaOH初始体积，mL;V为NaOH滴定后体积，mL；PNa o H 为NaOH质量浓度，g/L；D 为稀释倍数。2结果与分析2.1温度对除油菌生长及油脂去除的影响油脂在水中的溶解度很小，这是油脂很难被微生物降解利用的主要原因。油脂的溶解度与温度基本呈线性关系，温度越高，溶解度越高，越有利于油脂降解2 。温度对除油菌生长及油脂去除的影响如图1所示由图1（a）可见，随温度升高，菌体生长情况略有改善后转而下降，当温度为35 时，OD6和菌体质量浓度均最高，分别为2.7 1g/L和4.40 g/L

19、，其中，0 D6o与2 5 相比提高了5.6%，提高幅度不大。当温度继续升高时，OD6oo和菌体质量浓度明显下降，到5 5 时分别下降了8 4.9%和7 7.3%。该结果与Ke等的研究结果相符13,即随着温度升高，除油菌ODco降低。由图1(b)可以看出，油脂乳化能力和除油率与菌剂的生长情况变化一致。随着温度的升高，复合除油菌剂的乳化油脂能力和除油率均先升高后明显降低，35 时的油脂乳化能力及除油效果最佳，分别为0.5 6 7 和8 2.5 9%，这与Nayak等的研究结果相似14。温度升高到5 5 时，乳化油脂能力和除油率分别降低了46.6%和31.46%，降幅较大，说明尽管温度升高有利于油

20、脂溶解，高温对菌体生长的抑制是油脂降解的限制条件，同时说明复合除油菌剂的耐高温能力有一定局限，若后续将该复合除油菌剂应用到好氧堆肥中，有必要进一步提高耐高温菌的复配比例，以提高高温阶段复合除油菌剂的除油能力。2.2pH对除油菌生长及油脂去除的影响pH对除油菌生长及油脂去除的影响情况如图2所示。可见，在pH59时，ODc和菌体质量浓度分别保持在2.5 g/L和4.0 g/L左右，该复合菌剂对pH的适应性范围较广，生长较为稳定。当pH降低至4时，ODoo下降较为明显，从pH为5 时的2.5 0 4降低至1.9 9 7，菌体质量浓度也呈现相同的变化趋势，降34JOURNALVol.42lssue82

21、023ODOUIEINOEHINDCompound Degreasing MicrobialAgentLINGLing,et al:Studyonthe GreaseRemovalCharacteristicsSoftheAFREARCH0.7903.0rOD5乳化能力600800.6菌体质量浓度一除油率2.54700.52.06000930.41.50.321.00.2200.510.11000002535455525354555温度/温度/（a）菌体质量浓度(b）油脂去除率图1温度对菌体质量浓度和油脂去除率的影响Fig.1Influence of temperature on cell c

22、oncentration and oil removal rateOD3.060050.8乳化能力90厂菌体质量浓度0.7一除油率802.540.6702.0600.53%率制50ao1.50.420.31.0F300.2200.510.1100000456789456789pHpH(a)菌体质量浓度(b)油脂去除率图2 PpH对菌体质量浓度和油脂去除率的影响Fig.2Influence of pH on cell concentration and oil removal rate低至2.5 g/L。微生物表面电荷受pH影响，低pH降低了微生物对营养物质的吸收进而影响其生长5 。此外，低pH

23、条件不利于脂肪酶发挥水解作用。在堆肥发酵过程中，可采取一定措施避免体系pH低于5.0的情况出现，否则有可能导致酸化，影响微生物活性，甚至导致发酵停止。从图2(b）可以看出，随着pH升高，乳化油脂能力和除油率升高，分别从pH为4时的0.30 0 和54.%升高到pH为7 时的0.6 0 6 和7 9.41%，进一步升高pH至9 时，乳化油脂能力和除油率分别为0.680和8 1.2 6%。碱性条件下，脂肪在水中的溶解度增大，有利于微生物对油脂的吸收利用6,脂肪水解产生的脂肪酸可被碱中和，生成脂肪酸盐，使得该过程持续进行，因此pH为9 时的乳化油脂能力最强。综上所述，pH为7 9 时，菌剂的除油率均

24、在80%以上，该结果与Wu等和Joo等学者的研究结果基本一致17-18，说明中性偏碱的环境有利于油脂的乳化和降解2.3NaCI质量浓度对除油菌生长及油脂去除的影响微生物细胞壁可承受的渗透压为1x101x10Pa，相当于氯离子质量浓度2 gL。当氯离子质量浓度超过5 g时，渗透压增大，细胞因失水发生质壁分离，活性降低，严重时微生物死亡。NaCI质量浓度对除油菌生长及油脂去除的影响如图3所示。随着NaCI质量浓度升高，ODoo和菌体质量浓度分为2 个阶段：当NaCl质量浓度从5 g/L升高到20g/L时，OD6和菌体质量浓度逐渐下降，但变化幅度不大，分别从2.7 10 和4.40 g/L降低至2.

25、5 7 8和4.10 g/L，降低了4.9%和6.8%；其中NaCl质量浓度为10 g/L时，OD6和菌体质量浓度最高，说明10g/L的NaCl质量浓度有利于微生物的生长繁殖。当NaCI质量浓度逐渐升高时，ODoo和菌体质量浓度下降幅度增大，NaCl质量浓度为30 g/L时，ODoo为2.274，菌体质量浓度为2.0 5 g/L，与NaCl质量浓度为2 0 g/L相比，分别下降了16.1%和5 3.4%；当NaCI质量浓度增大到9 0 g/L时，ODoo和菌体质量品生物技术学报2023年第42 卷第8 期35凌复合除油微生物菌剂的油脂去除特性玲，研究论文3.06OD6002.5菌体质量浓度5（

26、/）/2.040091.531.020.5005102030507090NaCI质量浓度/(g/L)（a）菌体质量浓度0.6乳化能力90一除油率800.5700.460500.3400.230200.110005102030507090NaCI质量浓度/(g/L)（b）油脂去除率图3NaCI质量浓度对菌体质量浓度和油脂去除率的影响Fig.3Influence of NaCl content on cell concentrationand oil removal rate浓度分别下降了5 1.7%和7 0.5%。可见NaCl质量浓度或渗透压过高或过低，微生物的生长活性均受到抑制9由图3(b）可

27、以看出，NaCl质量浓度对乳化油脂能力和除油率的影响与菌体生长情况相近，即NaCl质量浓度为5 2 0 g/L时，乳化油脂的能力和除油率先升高后降低，并在10 g/L时取得最大值，为0.567和8 4.7 5%；当NaCl质量浓度超过30 g/L时，随着NaCI质量浓度升高，乳化油脂能力和除油率明显降低；当NaCl质量浓度为9 0 g/L时，乳化油脂能力和油脂去除率分别降低至0.313和43.8 7%，与NaCl质量浓度5 g/L时相比，降低了41.7%和46.49%。屈瑾等的研究表明当NaCl质量浓度过高时，外界渗透压高会抑制微生物活性2 0 ,使得微生物产酶能力下降、脂肪酶活性降低、除油效

28、果变差。2.4油脂质量分数对除油菌生长及油脂去除的影响图4为油脂质量分数对除油菌生长及油脂去除的影响。3.0r5OD6002.5菌体质量浓度4（/）/2.031.521.00.50012345油脂质量分数/%（a）菌体质量浓度乳化能力0.790除油率一0.680700.5600.4%率0.3300.2200.110002345油脂质量分数/%(b）油脂去除率图4油脂质量分数对菌体质量浓度和油脂去除率的影响Fig.4Influence of oil concentration on bacterial cellconcentration and oil removal rate可以看出，随着油脂

29、质量分数升高，OD6oo和菌体质量浓度先升高后缓慢降低。当油脂质量分数从1%升高到2%时，菌体生长情况得到改善，0 D6oo和菌体质量浓度分别为2.442 和4.30 g/L，提高了15.5%和8 7%。此后随着油脂质量分数升高，0 D6c和菌体质量浓度逐渐降低，至5%时，分别降低了10.6%和48.8%。该体系中，油脂是微生物生长的唯一碳源，质量分数过低或过高均不利于微生物生长，复合除油菌剂在油脂质量分数为2%的条件下，生长最好；当油脂质量分数为1%时，提供的碳源不足以满足除油菌的生长需要，当油脂质量分数高于3%时，油脂质量分数过高，其在液体表面形成油膜，阻碍了微生物生长所需氧气的传递，微生

30、物生长受到一定程度的抑制从图4(b)可以看出，除油菌乳化油脂能力和除油率的变化趋势与菌剂生长特别是ODoo的变化情况一致，即当油脂质量分数为2%时，乳化油脂能力和除油率最佳，达0.5 6 7 和8 4.49%；油脂质量分数为1%时，乳化油脂能力和除油率大大降低，高于36JOURNALOFFOODSCIENCEANDBIOTYVol.42lssue82023YCompound DegreasingMicrobial AgentLINGLing,et al:Study on theGreaseRemovalCharacteristicsoftheEARCH2%时，也出现不同程度的下降。通常随着油脂

31、质量分数升高，水中溶解氧质量浓度降低，微生物生长和活性受到抑制、产酶能力下降、乳化能力降低，不利于油脂的降解去除，该结果与柯霞等的研究结果一致2 1。另外，当油脂质量分数升高到5%时，OD6oo和菌体质量浓度分别为2.18 1和2.2 g/L，乳化油脂能力和除油率分别为0.5 0 1和5 5.0 7%，均高于油脂质量分数为1%时的情况，说明该复合除油菌剂对油脂质量浓度的适应范围较广，可在较宽的油脂质量浓度范围内稳定生长，可用于油脂质量浓度较高的餐厨垃圾或废水的发酵过程。2.5接种体积分数对除油菌生长及油脂去除的影响复合除油菌剂的接种体积分数对其生长情况及油脂去除的影响见图5。3.0OD6009

32、菌体质量浓度82.57(1/)/2.0651.541.0320.5103579接种体积分数/%(a）菌体质量浓度乳化能力0.790除油率一0.680700.560840.4%率0.3300.2200.1100013579接种体积分数/%(b）油脂去除率图5接种体积分数对菌体质量浓度和油脂去除率的影响Fig.5Influence of inoculation amount on cell concen-tration and oil removal rate可以看出，随着菌剂接种体积分数的增加，菌体生长情况先得到改善而后转而下降，当菌剂接种体积分数为5%时，生长情况最好，OD6oo和菌体质量浓度

33、分别为2.6 32 和7.45 g/L。当菌剂接种体积分数低于5%时，一定培养时间内，相对较少的除油菌无法较好乳化和降解相对较多的油脂，OD6oo和菌体质量浓度下降明显，当菌剂接种体积分数为1%时，分别降低了7.4%和17.4%。菌剂接种体积分数高于5%时，体系内提供碳源不足，同时前期菌体快速生长引起溶解氧不足，菌体生长情况由此受到不同程度的抑制。由图5(b）可以看出，该菌剂的乳化油脂能力及除油率的变化与其生长情况一致，接种体积分数为5%时，菌体质量浓度高，产生的脂肪酶多，乳化油脂能力和除油率最高，分别为0.5 39 和8 1.7 8%。在菌剂接种体积分数为1%9%时，最终油脂去除率都可以达到

34、7 0%以上，当接种体积分数大于5%时，除油率下降，可能是由于可利用的总溶解氧不足及营养物质被消耗所致2 2.6单一菌株的产脂肪酶能力微生物降解油脂的能力与脂肪酶的酶活有关，随酶活升高，油脂降解能力提高。各除油菌株所产脂肪酶的酶活及除油率随处理时间的变化情况见图6。8?一对照70050096B409(Tu/n)/B50154321米文0122436486072时间/h图6除油菌所产脂肪酶的酶活随时间的变化情况Fig.6Changes of lipase activity produced by degreasingbacteriaovertime随着处理时间的延长，脂肪酶的酶活先升高后降低。处

35、理至36 h时，菌株B501、菌株0 0 9、菌株005和菌株B409所产脂肪酶的酶活均达到最高，分别为6.5 8、6.2 8、5.5 8、4.9 2 U/mL，其中，菌株B501的产脂肪酶能力最强。处理至48 h时，菌株0 0 9 所产脂肪酶的酶活最高，为6.18 U/mL,且远高于其他337会品5 主物技术学报2 0 2 3年第42 卷第8 期凌复合除油微生物菌剂的油脂去除特性玲，研究论文株微生物，说明菌株0 0 9 持续产脂肪酶的能力较强。各单菌株除油结果表明，与其他3株微生物相比，菌株0 0 9 的除油率最高，为7 0.9 8%，这与其持续产脂肪酶能力较强有关。菌株B501和0 0 5

36、 的除油率分别为6 3.5 8%和6 6.0 3%，菌株B409的除油率最低,为44.5 6%3结语所得复合除油微生物菌剂的除油效果受温度、pH、Na Cl、油脂质量浓度和接种体积分数的影响较大，较佳除油条件为：温度35，pH9，含盐量10 g/L，油脂质量分数2%，菌体接种体积分数5%，除油率最高可达8 4.7 5%。单一菌株产脂肪酶的酶活及除油率的研究结果表明，各菌株在36 h时的产脂肪酶能力较强，此时菌株B501的脂肪酶酶活最高，为6.58U/mL，而菌株0 0 9 所产脂肪酶处于高酶活的持续时间较长，因此除油率最高，达7 0.9 8%。与单一菌株相比，复合除油微生物菌剂的除油率有所提高

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