1、 偏离比尔定律的因素主要有： 1被测溶液浓度过大 比尔定律只适用于测定稀溶液，在浓度高时由于产生吸收的组分 中粒子密度变大，以致每个粒子都可以影响邻近粒子的电荷分布，这 种粒子间的相互作用，使吸收辐射的能力发生了改变，以致发生偏离 。 2化学偏离 由于吸收组分的缔合、解离、光化学作用或与溶剂的相互作用， 使吸收峰的形状、位置、强度以及精细结构都发生变化，导致偏离。 3杂光的影响 比尔定律要求被测溶液吸收的光是单色光，但事实上由于分光光 度计的单色器的输出狭缝分离出的光常混有与选定谱带无关的杂光， 这种多色光，则导致对比尔定律的偏离。一般良好的可见紫外分光光 度计在全谱域杂光可保持低于0.1。由
2、表62可见，含杂光的比率 越高，对测定灵敏度的影响就愈大。 25 26 4谱带宽度的影响 在实际测定样品时，为了保证足够的光强，分光光度 计的狭缝必须保持一定宽度，因此，由出射狭缝投射到被 测物质上的光，并不是真正的单色光，而是一个有限宽度 的谱带，称为光谱带通。随着光谱带通宽度的增大，光源 谱带增宽，谱带的精细结构逐渐消失，峰值吸光度降低， 工作曲线的斜率也随之降低，从而偏离比尔定律。 5其它因素的影响 除上述主要因素外，试样中含有悬浮率或胶粒，以及 会产生荧光的物质都会使透射光强度减少而偏离比尔定律 。 27 (四)精密度与检出限 1精密度 可见及紫外分光光度计产生误差的主要来源， 在于吸
3、光度的测量误差。 根据比尔定律公式 可以改写为 上式左边换成自然对数，然后两边取微分，可得： 上述公式两式相除，经过整理可得下式： 28 如以有限值表示又可以写成 式中： 浓度相对误差， T透光率T测量中的绝对误差。 通常市售的分光光度计透光率的测量误差一般在0.002 到0.01之间。假设透光率测量误差T为0.005，通过以上公 式计算，可得到与T及A的函数关系数据列于表63。 29 表63 浓度百分误差的变差与透过率T、吸光度A的函数关系 （假定为T0.005） 透过率T 吸光度A 浓度百分误差 100 0.950.02210.2 0.900.0464.74 0.800.0972.80 0
4、.700.1552.00 0.600.2221.63 0.500.3011.44 0.400.3991.36 0.300.5231.38 0.200.6991.55 0.101.0002.17 0.0301.5234.75 0.020 1.699 6.38 30 2检出限 检出限不仅决定于吸光系数。也决定于所用仪 器的噪声水平。对多数商品分光光度计而言，1吸 收(T0.99，A0.004)与其最小可测信号相符。 在理想情况下，摩尔吸光系数可高达105，如使 用1cm光程吸收池，吸光度范围在0.1 1.5时，浓 度范围则为1106 1.5105 molL。 如果待测化合物的摩尔吸光系数为105，
5、使用 10cm吸收池则近似检出限将是4109 molL。 31 四、分子结构与电子光谱 （一）可见及紫外吸收光谱的产生 物质的分子在室温下，一般处于基态能级，当它受到 电磁辐射的作用时，吸收一定能量的光子，使分子受到激 发，就从原来能量较低的基态能级跃迁到能量较高的能级 (激发态)，而产生吸收光谱。 分子跃迁有三种类型，即电子跃迁，振动跃迁及旋转 跃迁，这三种跃迁所需的能量不同，可以产生三种不同的 吸收光谱，即电子光谱、振动光谱及转动光谱。 振动光谱及转动光谱能级跃迁需要能量较小，位于红 外区及远红外区，电子跃迁所需能量最大，在120eV(电 子伏特)之间，位于可见与紫外光区，这种光谱又称为电
6、 子光谱或可见紫外光谱。本章要讨论的可见紫外光谱就是 由电子跃迁所产生的。 32 1有机化合物中价电子的类型 在有机化合物中有几种不同性质的价电子，根据分子 中电子成键的种类不同，可分为三种类型：形成单键的电 子称为键电子；形成双键的电子称键电子，氧、氮、 硫、卤素等含有未成键的电子称为孤对n电子。以醛基为 例示意如下： 当有机化合物吸收紫外光时，这些价电子可以从基态 跃迁到较高的能级状态(受激态)，此时电子所占的轨道称 为*，*反键轨道。 33 2电子跃迁的类型 有机化合物分子中电子跃迁的方式与键的性能有关。 电子跃迁主要有下面几种类型，即*、n*、n* 及*。各种跃迁所需能量大小为 *n*
7、 *n* 见图66所示。 通常当电子由一个能级跃迁到另一个能级时，同时伴 随有振动能级和转动能级的跃迁。因此，所得到的吸收光 谱不是线状光谱而是带状光谱。 34 35 (二)几个常用术语 1生色基(又称发色基团) 有机分子中能够吸收紫外或可见光而引起电子跃迁的 不饱和基团叫做生色基 (Chromophores)又称发色基团 (Chromophoric group)。 生色基主要是指共轭多烯系统，含有未成键电子对的 双键结构或基团、芳香基团及部分含有未成键电子对杂原 子的基因。常见生色基的最大吸收峰见表64。 36 37 2助色基(又称助色团) 某些含有未成键电子对的原子或基团，称为助色基 (A
8、uxochrome)，助色基本身在紫外区没有特征吸收带， 但当它们与生色基连在一起时，可以使生色基所产生的吸 收峰向长波方向移动，并使其强度增加。这类基团有 OH、NH2、SH、 SO3H、 COOH、 Cl、 Br等。 3红移、蓝移、增色效应、减色效应 红 移(Bathchromic)：指因结构变化(如顺反异构)、共轭体 系加大、助色基效应、溶液pH变化等引起吸收峰向长波 移动的效应。 蓝移(Hypsochromic)：指由于取代基或溶剂等的影响， 使吸收峰向短波方向移动的效应。 增色效应(Hyperchromic effect)：由于结构变化或其它 原因使吸收强度增加的现象。 减色效应(H
9、ypochromlc effect)：使吸收强度减弱的现象 。 38 (三)有机化合物结构与电子跃迁及吸收谱带的关系 1饱和单键碳氢化合物 只含键电子，电子结合的很牢固，只有吸收很大能 量后才能产生*跃迁。在近紫外区没有吸收峰，只有 在远紫外区(10一200 nm)才有吸收峰。这已超出了紫外可 见分光光度计的范围，应用不多。 2饱和烃中氢被氧、氮、硫、卤素等原子所取代 由于这类原子中有孤对n电子(如HH2、OH、 S、X等)n电子较电子容易激发，可产生n*跃迁， 此种跃迁所需能量较*小。含这些原子的化合物在 150250 nm的紫外区有吸收峰、少部分在近紫外区( 200 nm)有吸收。表65列
10、出了能进行n*跃迁的一些 基团和原子。 39 40 3不饱和碳氢化合物 含有键电子，它比n电子更易于激发可以产生 *跃迁，此种跃迁的能量较*及n*都小。吸 收峰大都位于紫外区(200 nm)。 具有共轭双键的化合物，由于相间的与键相互作 用。形成大键，使电子更容易激发，可使吸收峰波长向 长波方向移动。共轭分子的吸收光谱通常有两条谱带，一 种称为K带(德文“共轭作用”得名)，是由*跃迁所产 生。这种跃迁是整个共轭键的基态向激发态的跃迁。例如 CCCCCCCC；另一种称为R带(德文“ 基团”得名)为n*跃迁所产生。为共轭体系一端的单个 生色基的跃迁。如CO、NO2、NN、N O等。 41 42 4
11、芳香族化合物 主要包括苯及芳香杂环的衍生物： (1)苯：苯为环状共轭体系。 其紫外光谱特征是具有*跃迁所引起的三组谱 带。 在180184nm处(47000)、有强吸收的E1带，因 在远紫外区，实用意义不大。 在204nm处(7900)有中强吸收的E2带，E2带在末端 范围，也不常用。 在230270 nm处(200)有弱吸收的B带。B带是由 *跃迁及振动效应的重叠引起的一系列锐峰，又称“ 精细结构”吸收峰。在气体或非极性溶剂中精细结构较清 楚，在极性溶剂中，精细结构消失。图67、图68分别 为苯的紫外光谱及苯酚的B吸收带。 43 44 (2)苯的单取代物： 在苯环上有取代基时，复杂的B吸收带
12、一般都简单化 ，向长波移动，同时吸收强度增加。 烷基取代：由于超共轭作用(hyperconjugation)产生 红移，但效应不大。 带弧对电子基团取代：如NH2、OH、OK等由 于弧对电子与苯环上的电子产生n共轭使吸收强度增 加产生红移。 与苯环共轭的不饱和基团取代：如CHCH、C O、NO2等。由于共轭，产生新的电子轨道，使 波长显著红移。 总之、取代苯对光谱红移影响的大小与取代甚的拉电 子和推电子的程度有关。表67列出一些单取代苯的紫外 吸收数据 45 46 (3)苯的二取代物： 在二取代苯中，由于取代基的性质和取代位置不同， 产生的影响也不同。 当一个吸电基(如NO2、CO)及一个供电
13、基(如 OH、OCH3、X)互为对位时，由于两代基的效应相 反，产生协同作用，使波长显著红移。若两个效应相反的 取代基互为间位或邻位时，则二取代苯与各单取代苯的波 长区别很小。例如 为280nm， 为 380nm， 为280nm。 47 当两个取代基都是吸电基或都是供电基时，由于效应相 同，两个基团不能协同，则吸收峰往往不超过单取代基时 的波长，且邻、间、对位三个异构体的波长也相近。例如 为260nm， 为258nm， 为255nm， 为255nm。 48 (4)稠环芳香族化合物： 此类化合物由于共轨体系增加，使波长红移，吸收强 度增加。 例如萘有三个吸收谱带，E1谱带为220nm， 1000
14、00，E2谱带为275nm，5700，B吸收带为312nm ，250。菲的谱带E1为252nm，50000，E2293nm ，16000，B谱带为330 nm，250。表69列出了一 些稠环芳烃的吸收谱带。 49 50 (5)杂芳环化合物 五元杂芳环化合物：如吡咯、呋喃、噻吩，可看作是环 戊二烯的C1被杂原子取代。因此，紫外光谱与环戊二烯相 似。一般有两个吸收峰，在200 nm附近有一个峰，属K带 ，在238nm附近还有一个峰，类似苯环的B带。例如： 200nm，238.5nm 200nm，252nm 211nm，240nm 231nm，269.5nm 六元杂芳环化合物：六元杂芳环化合物的紫外
15、光谱与苯 相类似，例吡啶在257nm有吸收峰与苯的B带相似，也有 精细结构，而其n*跃迁引起的弱峰多被B带覆盖。极 性溶剂可使吡啶的B带吸收强度明显增高，这可能是吡啶 氮原子上的弧对电子与极性溶剂形成氢键的原故。 51 5吸收谱带 跃迁类型相同的吸收峰称为吸收谱带又称吸 收带。化合物结构不同，跃迁类型不同、因而有不同的吸 收带。在前面化合物结构与电子跃迁的关系中已提到各种 吸收带。现将吸收带的种类与特点扼要总结如下： (1)R吸收带：由n*跃迁产生的吸收带，它具有杂原子 和双键的共轭基团。如， ，NO2，NC等 。该带的特点是吸收强度很弱，处于长波方向，吸收峰波 长一般在270 nm以上。 (
16、2)K吸收带：由共轭的*跃迁产生的吸收带，其特点 是吸收峰很强104。共轭双键增加，波长红移，而且吸 收强度增加。K带是共轭分子的特征吸收带，借此可判断 化合物中共轭结构。 52 (3)B吸收带：这是芳香族化合物的特征吸收带，由苯的 *跃迁所产生。为一宽峰并出现精细结构。吸收峰在 230一270 nm之间，B带的精细结构常用来识别芳香族化 合物，但当苯环取代后或用极性溶剂时，精细结构消失。 (4)E吸收带；E带可分为El、E2两个吸收带。二者可分别 看成是苯环中的乙烯键和共轭乙烯键所引起的，也属 *跃迁。E1带吸收峰在l 84nm左右，在远紫外区不常 用。E2带在203nm处有吸收，E2带有些
17、书籍也称它为K带 。E2带可因苯环上引入助色基而向红移。当苯环上引入生 色基时，吸收峰显著红移，此时E2带就称为K带。 53 五、定 量 分 析 （一）试 样 的 制 备 1溶剂的选择 可见紫外分光光度测定，通常都是在溶液中进行，因 此选择合适的溶剂十分重要。 选择溶剂应考虑的原则是：对试样有良好的溶解能力 和选择性；在测定波段内溶剂本身无明显吸收；溶剂不得 与被测组分发生化学反应；被测组分在溶剂中具有良好的 吸收峰形。 对于紫外光谱分析，选择溶剂更为重要，因为极性溶 剂对电子跃迁产生的谱带有影响。因此在紫外测定时，在 溶解度允许的范围内，应尽量选择极性小的溶剂。分光光 度法常用的有机溶剂见表
18、610。 54 55 2样品的净化 样品中含有杂质，会直接影响分光光度法的测定结果， 因此，测定前必须进行净化。 农药原药和制剂中都含有许多杂质，测定前都必须进行 净化处理，常用的方法有薄层层析、液液分配、柱净化等。 也可以用水解、氧化还原或调节酸碱性方法等，消除干扰。 56 (二)测量条件的选择 1波长的选择 应选择被测组分最强吸收带的最大吸收波长(max) 作为测量波长。因为在max处，待测组分每单位浓度的 吸光度值变化最大，测量灵敏度较高，而且吸收曲线在最 大波长附近较为平坦，可以较好的遵守比尔定律。 有时为避开杂质的干扰，而选择灵敏度稍低的不受干 扰的次强吸收峰或肩峰等进行测量。 2狭
19、缝宽度的选择 狭缝宽度直接影响测定灵敏度和校正曲线的线性范围 。狭缝宽度增大，在一定范围内可使灵敏度下降，校正曲 线线性变坏，偏离比尔定律。狭缝也不是越小越好，狭缝 太小，入射光强度变弱，也不利于测定。一般应选择不减 少吸光度时的最大狭缝宽度为测量宽度。 57 3吸光度与浓度之间关系的确定 在确定了分析条件之后，必须用一系列标准溶液制作 一条标准曲线，标推曲线的浓度范围应接近实际试样的浓 度，并在此浓度上下一定范围包括待测样品的浓度范围， 通过标准曲线的制作，可以了解遵循比尔定律的浓度范围 。 4空白溶液的选择 空白溶液亦称为参比溶液，在分光光度法测定样品时 都需要有空白溶液作为参比。在仪器上
20、将空白溶液的透光 率调成100，以作为测量时的相对标准。 空白溶液除了具有参比作用外，在分光光度测定中， 还可以用来抵消某些杂质的干扰例如所用试剂或溶剂不 纯、显色剂本身有颜色、以及无法去除的杂质色泽等，都 会影响吸光度的测定，此时可用相应的空白溶液消除其影 响。 58 (三)反 应 条 件 1显色剂的选择 在可见光区进行分光光度测定时，常需选择合适的显色剂将被 测组分转变为有色化合物或络合物，然后进行测定。 选择显色剂的原则是： 显色反应灵敏度高，般应在100 ppm以内； 显色剂选择性好，对杂质无反应或反应小； 显色稳定性好，生成的有色化合物颜色要稳定，组成要恒定； 符合比尔定律； 受溶液的酸度、温度等因子影响要小等。 59 2显色条件的选择 显色条件包括试剂的浓度、溶液的酸度、显色时间、反应温度 、杂质的干扰等。 (1)试剂的浓度： 显色过程中加入的试剂或显色剂的量，会影响有色化合物的组成 ，常使颜色发生变化，因此试剂(显色剂)的加入量必须通过实验确定 ，应做一条吸光度与试剂(显色剂)浓度的变化曲线，在吸光度值恒定 的范围内确定试剂(显色剂)的浓度。 (2)溶液的酸度： 显色过程都是在一定的酸度条件下进行的，酸度高低对络合物的 形成，颜色的稳定性，水
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