1、登记序号 项目编号 科研设计书项目名称： 日本血吸虫尾蚴性别鉴定应用技术的研究承担单位： 单位地址： 邮政编码： 开 户 行： 帐 号： 1103021109000077488项目负责人： 电 话： 职务职称： 填报日期 2004年7月28日江苏省地方病协会二四年制一、 立项依据：血吸虫是一具有两性染色体的吸虫，有8对染色体，其中雌性性染色体为异配子体（ZW），雄性为同配子体（ZZ）。尽管雌性和雄性成虫阶段具有明显的性别二态性，可用肉眼区别，但在幼虫阶段即毛蚴、胞蚴和尾蚴阶段，无明显的性别二态性，肉眼难以区别。传统动物感染方法，是在实验室内取感染了血吸虫的鼠或其它啮齿类动物的肝、肠或粪便收集虫
2、卵，孵化毛蚴，用单只毛蚴感染单只钉螺，养殖筛选阳性钉螺，获得单性尾蚴，用以感染啮齿动物，待其发育至成虫阶段，解剖动物收集成虫，用肉眼或在解剖显微镜下根据形态学的差异，确定感染尾蚴性别。然而，单性雌性尾蚴不能发育到完全成熟的成虫，给鉴别带来一定困难。同时常规方法需要花费时间长，日本血吸虫从尾蚴感染动物到发育成熟至少需3周。采用分子生物学的方法，可快速鉴定尾蚴的性别。代表性差异分析（RDA）方法是基于递减杂交法，用于发现两DNA基因组群间差异，是一种改良的扣除杂交法，并可用于分离基因组间差异性片段。由于血吸虫为两性染色体的吸虫，其雄性为同性配子体（ZZ），而雌性为异性配子体（ZW）。RDA方法从宏
3、观上看，系用雄虫染色体ZZ去扣除雌虫染色体中的Z，从而获得W染色体。Drew A.C.等（1995）采用此方法分离出两段曼氏血吸虫雌性特异性序列，并将其制备成探针，用Southern blot 方法证实只与曼氏血吸虫雌性基因组DNA特异性杂交。W1重复序列作为雌性特异性序列，存在于曼氏血吸虫波多黎各株生活史的各个阶段。并根据曼氏血吸虫雌性该特异性序列W1设计出一对引物W1a和W1b。直接加入该引物对单个尾蚴作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳。结果雌性尾蚴呈现扩增产物PCR-W1条带，雄性尾蚴不呈现扩增条带。此方法能快速、可靠地用来鉴定曼氏血吸虫尾蚴的性别。基于曼氏血吸虫尾蚴性别鉴定的现有方法，为探索
4、适合日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法提供了理论和方法依据。利用代表性差异分析（RDA）方法，分离出日本血吸虫雌性特异性序列，将此特异性序列制备成DNA探针，用Southern blot 方法鉴定日本血吸虫尾蚴性别。也可对此特异性序列进行测序，设计一对引物，对单个尾蚴的DNA作PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，则雌性尾蚴呈现扩增条带，雄性则不呈现扩增条带，从而用PCR方法可快速鉴定日本血吸虫单个尾蚴的性别。研究日本血吸虫尾蚴的性别鉴定技术，建立日本血吸虫尾蚴快速鉴定应用技术有助于血吸虫幼虫阶段生物学和生理学实验的研究；对血吸虫病疫苗评价方法的标准化、遗传学的研究；及其流行病学、感染诊断和病理学研究结果的正确
5、评价；不同性别尾蚴的易感性和感染比率以及减虫率（减雌率）和减卵率的正确评估等均具有重要的意义。同时为进一步开发适合我国国情的日本血吸虫尾蚴性别鉴定试剂盒打下基础。二、 主要研究内容、关键技术、目标：1、 研究内容1.1 用代表性差异分析方法获得日本血吸虫雌性基因组DNA特异性序列。1.2 对特异性序列测序，设计引物，PCR扩增。1.3 实验室内建立一种简单、快速的日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法。2、 关键技术2.1 日本血吸虫雄虫、雌虫基因组DNA的提取2.2 代表性差异分析方法（RDA）和PCR。2.3 低熔点凝胶回收雌性特异性片段2.4 大肠杆菌E.coli TG1感受态细胞的制备技术、DNA
6、的重组和克隆筛选、重组DNA的转化及质粒DNA的提取。2.5 DNA探针的制备和Southern blot 验证方法2.6 雌性特异性序列测序和引物设计。3、 目标建立一种简单、快速、灵敏的日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法。三、 研究方法及技术路线1. 用传统方法确定尾蚴的性别，获取单性尾蚴样本1.1 以逸蚴法筛选出阴性钉螺用于感染，所有用于实验的螺均筛选3次。1.2 以单只毛蚴感染单只钉螺；螺感染后在光照培养箱中养殖90天或在春夏季室温条件下养殖100天。逸蚴法筛选出阳性钉螺，取单性尾蚴感染小鼠，35天后剖杀，取成虫确定尾蚴的性别。并分别收集单性尾蚴分别编号保存于-70液氮备用。2. 用代表性差异
7、分析方法分离日本血吸虫雌性特异性序列2.1 感染家兔4只，每只约用1500-1800条尾蚴。45天后剖杀家兔，收集成虫，在解剖镜下将成虫雌雄分开，分别保存于-70液氮中备用。2.2 取雌虫、雄虫各200条用基因组DNA提取试剂盒分别提取雌虫和雄虫的基因组DNA。2.3 用限制性内切酶Hind对雌虫、雄虫DNA进行酶切。将酶切产物与两条适配子（R Hind24,5-AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGCA-3和R Hind12,5-AGCTTGCGGTGA-3）组成的接头用T4连接酶进行连接。2.4 以连接物为摸板，做PCR扩增；并琼脂糖凝胶电泳看连接情况。2.5 扩增子的纯化 对雌虫、
8、雄虫DNA的PCR产物用PCR纯化试剂盒纯化，限制性内切酶Hind酶切。将酶切后的PCR产物过交联葡聚糖G-50柱去除适配子接头R Hind24和R Hind12。如此制备的雌虫DNA为检测子，雄虫DNA为驱动子。2.6 扣除杂交法及PCR2.6.1 取以上的检测子1ug连接新的适配子接头（J Hind24 5-ACCgACgTCgACTATCCATgAACA-3和J Hind12 5-AgCTTgTTCATg-3）；然后取0.5ug带有新接头的检测子与40ug的驱动子溶于4ul的3EE缓冲液中，加入1ul的5M的NaCL，扣除杂交，67、20小时；并做PCR和琼脂糖凝胶电泳。2.6.2 将R
9、DA的第一轮PCR产物酶切后，过交联葡聚糖G-50柱去除适配子接头J Hind24和J Hind12，连接下一个新的适配子接头（N Hind24 5-AggCAgCTgTggTATCgAgggAgA-3和N Hind12 5-AgCTTCTCCCTC-3），取检测子0.1ug与40ug驱动子进行第二轮RDA，PCR和琼脂糖凝胶电泳。2.6.3 同上，酶切后过交联葡聚糖G-50柱去除适配子接头N Hind24和N Hind12，再连接适配子接头J Hind24和J Hind12，取400pg检测子与40ug驱动子进行第三轮扣除杂交，PCR和琼脂糖凝胶电泳。2.7 将获得的特异性DNA片段进行低熔
10、点琼脂糖凝胶回收，PCR纯化试剂盒纯化。2.8.1 制备大肠杆菌E.coli TG1感受态细胞：本实验以E.coli TG1菌株为受体细胞，用氯化钙处理是受体菌处于感受状态。2.8.2 DNA的重组和克隆筛选：将获得特异性DNA片段连接到载体质粒pUC19制得重组质粒；经-互补现象筛选（蓝白斑筛选）方法对重组质粒进行筛选。2.8.3 重组DNA的转化：用电击转化的方法，设定电击仪参数（电脉冲25uF、电压2.5KV、电阻200）；吸取一定量的感受态细胞和重组质粒pUC19，加入预冷的电击杯，放入样品池，按以上设定参数启动对细胞的电脉冲，仪器会显示4-5ms具有12.5KV/cm的电场强度，脉冲
11、结束后，将细胞取出加入到1mlSOC培养液中复苏1h，接种于特制平板上，37培养。2.8.4 挑选培养出的单个白色菌落，接种于液体培养；用质粒DNA提取试剂盒提取质粒DNA。2.9 Southern-blot 方法验证：利用DIG DNA Labeling andDetection Kit制备DNA探针和Southern-blot验证。3. 将经Southern-blot方法验证出的雌虫特异性序列进行测序，并设计引物。4. 根据设计好的引物，对提取的成虫基因组DNA和已知性别的尾蚴DNA作PCR，琼脂糖凝胶电泳来进行证实。5. 根据设计好的引物，采用直接法（不提取DNA）对单个尾蚴作PCR，琼
12、脂糖凝胶电泳，来确定此尾蚴的性别。6日本血吸虫尾蚴性别鉴定PCR法操作条件优化研究。四、 现有工作条件和基础：1 工作基础本实验室是江苏省寄生虫分子生物学重点实验室，寄生虫学为江苏省135重点学科，拥有清洁级小鼠动物房，从事寄生虫免疫学和分子生物学研究二十余年，在仪器设备上完全具备进行寄生虫免疫学和分子生物学研究以及动物试验的的条件。有一定的专业技术和专业人员队伍，人员配置合理。2 仪器设备主要包括温控设备：4、-20、-70冰箱、THZ-95型恒温振荡器、SCS-24型摇床、光照培养箱、恒温水浴箱、微波炉等；净水设备：MilliQ水纯化设备；消毒设备：高压蒸气灭菌锅；计量设备：各种精密度天平
13、、量筒、移液管及各种规格的可调试微量移液器、PH计、紫外分光光度计等；离心设备：各种不同规格的普通、高速冷冻离心机；蛋白核酸分析设备：DY-A琼脂糖凝胶电泳仪、多功能蛋白电泳仪（Bio-Rad）、核苷酸序列分析仪（Bio-Rad）、核酸蛋白测定仪(BECKMAN)、快速蛋白液相层析系（Pharmacia）等；其它分子生物学仪器：PCR仪、超声仪、电穿孔转基因仪、干胶仪、酶标仪、凝胶扫描仪、影像密度扫描仪等。五、 计划进度：总期限一年：1-3月 采购钉螺，并筛选阴性钉螺。2-4月 购阳性钉螺并感染家兔，剖杀家兔收集成虫和虫卵。4-5月 单只毛蚴感染单只钉螺.4-5月 订购试剂5-11月 分离雌虫特异性序列，并测序和设计引物，进行尾蚴性别鉴定。11-12月 收集、分析资料和书写总结报告六、 项目研究预期成果及效益 采用分子生物学技术，建立一种快速、准确、有效的日本血吸虫尾蚴性别鉴定方法，并为进一步开发响应的鉴定试剂盒打下基础；和发表相应的论文。七、 经费预算试剂 万元试验动物 万元试验耗材费 万元交通、差旅费用 万元管理费 万元总计 万元八、 主要研究人员单位 姓名 性别 年龄 专业 职务（称）项目中的作用九、单位意见、盖章 年 月 日 十、主管部门意见、盖章 年 月 日
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