2019留学澳大利亚心得与体会.docx
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1、ICS 65. 020. 30 B 44 DB14 山西省 由巳 ET圃, 、万 标准 DB 14/T 1942-2019 实验动物中国地鼠微卫星DNA检测方法 Laboratory animal Method for microsatellite markers of Chinese hamster 2019 -12 -01发布2020 -02 -01实施 山西省市场监督管理局 发布 DB14/T 1942-2019 目次 前言. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 I 范围. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 术语和定义. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3、 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 3 抽样. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 方法.2 DB14/ T 1942一一2019 II 目IJ1=1 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编
4、写。 本标准由山西省科学技术厅提出、归口并监督实施。 本标准起草单位:山西医科大学。 本标准主要起草人:宋国华、刘田福、陈朝阳、高继萍、张锐虎、续国强。 DB14/T 1942-2019 实验动物中国地鼠微卫星DNA检测方法 1 范围 本标准规定了实验动物中国地鼠(以下简称实验中国地鼠)遗传检测抽样数量及微卫星DNA检 测方法。 本标准适用于实验中国地鼠品系鉴别、质量控制及遗传组成分析。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 实验中国地鼠laboratory Chinese hamster 指经人工饲育,对其携带的微生物和寄生虫实行控制,遗传背景明确或者来源清楚,用于科学研究
5、、 教学、生产和检定以及其它科学实验的中国地鼠(Gricetulusgriseus)。 2. 2 近交系中国地自inbred strain Chinese hamster 以全同胞或亲子交配方式繁殖20代以上的中国地鼠,近交系数达98.6%以上。 2.3 封闭群中国地鼠closed colony Chinese hamster 以非近亲交配方式繁殖中国地鼠,在不从外部引入新个体的条件下,至少连续繁殖4代以上。 2.4 微卫星DNAmicrosate11ite DNA 是指基因组中由16个碱基组成的串联重复序列。不同个体的重复数不同而形成了微卫星DNA 的多态性。 3 抽样 对j丘交系中国地鼠抽
6、样数量不做要求。每个封闭群随机抽取非同窝成年实验中国地吕立,雌雄各半。 采样数量按表l进行。 DB14/T 1942-2019 表1封闭群实验中国地鼠遗传检测抽样要求 群体数量(只)抽样数量(只) 少于100?15 大于100?30 4 方法 4. 1 采样 观察动物外观,核对编号,中国地鼠取0.5cm尾尖组织或眼眶静脉丛采血,-20C低温保存。 4. 2 微卫星位点的选择 各微卫星位点的名称、引物序列、等位基因数、PCR反应的退火温度见表20PCR引物的5端用 FAM荧光染料进行标记。近交系中国地鼠在表2中选择10个微卫星位点,封闭群中国地鼠在表2中选 择15个微卫星位点。 表2中国地鼠微卫
7、星佳点 位点引物序列退火温度(oC)片段大小最大等位基因数 F:AGGCTGCTTCCTAAACCCAT Chm35 51 354-391 4 R:CTGGGAAGGCTGAACTCAAG F:TCTGTGTGTCTGTGAATGCG Chm93 58 242-299 7 R:GGATGTAAGATGGCTCCGAA F:CATCTGGGCTTTCAATGGAT Chm147 58 233-292 9 R:GCTCCCTAAATAACCCCCAA F:AGGGGAGATCTTGGGTCAGT Chm79 51 270-355 5 R:AACATGGAGGAGCACAAACC F:GATAGGA
8、GGGAGCAAAAGGG Chm120 58 376-432 12 R:CCTGAGAGCCTCAGAGCAGT F:TCTTCCCTTCACAACCCAAG Chm162 58 167-214 12 R:AGCAGTGCCCTTTGAAACAT Ch日110F:GGCTGGTGATTTCAATGGTT 59 217-357 5 2 DB14/T 1942-2019 R:GTTCTTAATGGATCTACCCTGGGACC F:CAATGGCTGCTAAGAGAGGG Chm108 59 392-471 5 R:GTTCTTTCCCACTCACAATTTTCCTTG F:TACTCCTGTC
9、TCCACCTCCC Chm115 59 171-220 6 R:GTTCTTTCTGGGGGATGTATGCTCTC F:CAGATGCCCAAACTCTCTCC Chm124 59 355-404 4 R:GTTCTTGTCACCCCATGGACTACACC F:TGCCCACATACATGACACAA Chm134 59 383-428 5 R:GTTCTTTCCCAACACCCTCTTCTGAC F:GACCCCATTCGTAAACCAGA Chm14 59 259-316 4 R:GTTCTTCCCCACAGTCAGCCCTATATT F:GCAGCTGGTTTTGAGCTACC C
10、hm140 60 168-205 7 R:GTTCTTTGTTTGATCACTGGAACCCA F:AAAGGCCTTGAGGTGGAGTT Chm48 60 369-448 10 R:GTTCTTGAGGTAGGCAGGGACTGACA F:AGTTTGATGATCCCCAGCAC Chm54 59 326-367 6 R:GTTCTTCTACCCCTCTCAGCAACCTG F:GACAGATCCCGACCCATTTA Chm9 59 118-145 5 R:GTTCTTGTCCTGAGCAAGTCCAGAGC F:GCAGAAGCACAAACCAACAA Chm91 59 104-145
11、 7 R:GTTCTTAGGCCAAGCTCTTCTCTTCC 4.3 PCR 扩1曾 4.3.1 提取基因组DNA 用苯盼氯仿法或试剂盒提取基因组DNA。 4.3.2 PCR扩增体系 PCR扩增总体积为10L,其中DNA(20 ng /L) 0.8L, 10 x Buffer 1.0L, Mg2+( 25 mmo1!L) 0.8 L, d NTP( 2.5mmol / L) 0.8L,上、下游引物(1 pmol/ L)各0.1!lL,Taq DNA聚合酶(5U /L) 0.1 L, dd H20 6.3L。 PCR扩增程序:94 0C预变性 5min; 94 0C变性 30s,退火(退火温度
12、见表2)30 s, 72 Oc延伸45 s, 35个循环72Oc延伸20mino扩增产物40C保存。 3 DB14/T 1942-2019 4.3.3 PCR产物的检测 PCR产物,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳以及凝胶成像系统拍照检测扩增结果。 4.3.4 扩增产物的STR扫描 扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳检测确保扩增出目的片断后,选择以FAM蓝色荧光标i己的扩增产物, 取lL上样进行STR扫描。 4.4 STR扫描结果的要IJ卖与统计分析 4.4.1 STR扫描结果的判读 扫描结果出现两种波形:一种为纯合基因型,只有一个主波:另一种为杂合基因型,有两个主波。 同时,根据软件读出波峰处的扩增产物的
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