餐饮行业安全工作机制.docx
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1、-半乳糖苷酶基因工程菌的开发学 院:专 业:姓 名:指导老师:材料与环境学院生物工程邓智远学 号:职 称:160504104076刘小刚 梁伟凡讲师 高级工程师中国珠海二二年五月北京理工大学珠海学院16届本科生毕业论文诚信承诺书本人郑重承诺:本人承诺呈交的毕业论文-半乳糖苷酶基因工程菌的开发是在指导教师的指导下,独立开展研究取得的成果,文中引用他人的观点和材料,均在文后按顺序列出其参考文献,设计使用的数据真实可靠。本人签名: 日期: 年 月 日-半乳糖苷酶基因工程菌的开发摘 要-半乳糖苷酶(-Galactosidase,EC 3.2.1.22), 是一种催化水解-D-半乳糖苷(如半乳糖寡糖、半
2、乳糖甘露聚糖)非还原性末端-D-半乳糖苷键的酶。此酶在食品以及饲料方面大量运用。但是由于目前-半乳糖苷酶的生产水平较低,成本较高,满足不了工业应用上的需求,所以本论文旨在通过分子生物学技术构建高效表达-半乳糖苷酶基因工程菌,降低生产成本,为工业应用奠定基础。本论文调研了AB、AC、AA、AZ和AF五种不同来源的基因,并构建了pPICzA-AB、pPICzA-AC、pPICzA-AA、pPICzA-AZ和pPICzA-AF五种-半乳糖苷酶重组表达质粒,通过筛选比较, AA基因的酶活最高,50L发酵罐酶活达到912U/mL。后续在AA菌株的基础上,通过增加AA基因的拷贝数以及共表达HAC1分子伴侣
3、蛋白两种方式继续提高AA菌株的酶表达能力,结果共表达分子伴侣的菌株酶活大幅提高,其发酵液酶活高达4663U/mL,是AA菌株的5.1倍,也是目前公开报道的最高水平。本研究从-半乳糖苷酶高酶活基因筛选和蛋白高效表达策略两方面入手,构建了高效分泌表达-半乳糖苷酶的毕赤酵母工程菌,其发酵161小时的酶活达到4663U/mL,是目前公开报道的最高水平,本研究工作为-半乳糖苷酶的工业化生产和应用奠定了基础。关键词:-半乳糖苷酶;巴斯德毕赤酵母表达系统;基因筛选;蛋白高效表达Development of -galactosidase producing strainAbstract-Galactosida
4、se (EC 3.2.1.22), is one kind of enzyme that hydrolyze non-reducing terminal -D- galactosidic bonds in -D-galactoside. The enzyme is currently widely used in food and feed industry. However, due to the low production capacity and high cost of -galactosidase, it cannot meet the needs of industrial ap
5、plications. In order to reduce the producing cost,this research aims to construct engineered Pichia pastoris strain with high level secretory expression of -galactosidase through molecular biology. In this research,five -galactosidases (AB, AC, AA, AZ and AF) from different species were investigated
6、 and their expression vectors were constructed, named pPICzA-AB, pPICzA-AC, pPICzA-AA, pPICzA-AZ and pPICzA-AF, respectively. Among these genes, AA strain showed the highest activity and the activity of the fermentation broth reached to 912U/mL. Subsequently, two methods were applied to improve the
7、expression of -galactosidases including increasing gene copy number and co-expressing of chaperone HAC1. The result showed that co-expression of HAC1 had obvious improvement on -galactosidases expression while increasing gene copy number had no influence. The activity of AA/HAC1 strain was up to 466
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