1、生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 17 卷 第 6 期 2022 年 12 月Vol.17,No.6 Dec.2022 基金项目:国家自然科学基金资助项目(41967051,42167059)第一作者:任洪玥(1996),女,硕士研究生,研究方向为环境毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20220110001任洪玥,杨进,刘霞,等.二氧化硫体内衍生物通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导大鼠切牙成釉器细胞 AE2 蛋白表达上调J.生态毒理学报
2、,2022,17(6):256-265Ren H Y,Yang J,Liu X,et al.Internal derivatives of sulfur dioxide induced up-regulation of AE2 protein expression of rat enamel organ through ROS/JNK/AP-1 pathway J.Asian Journal of Ecotoxicology,2022,17(6):256-265(in Chinese)二氧化硫体内衍生物通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导大鼠切牙成釉器细胞 AE2 蛋白表达上调任洪玥1,2
3、,杨进1,2,刘霞1,2,姚杰1,2,林昌虎1,涂成龙1,2,3,*1.贵州医科大学公共卫生与健康学院,贵阳 5500252.贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室,贵阳 5500253.贵州医科大学毒性检测中心,贵阳 550025收稿日期:2022-01-10 录用日期:2022-02-21摘要:探究二氧化硫体内衍生物混合液(亚硫酸钠与亚硫酸氢钠物质的量比为 31)对雄性大鼠切牙组织抗氧化防御系统及切牙成釉器细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路关键蛋白与阴离子交换蛋白 2(ani-on exchanger
4、 2,AE2)表达的影响。30 只雄性 Wistar 大鼠按体质量随机分为高(100 mgkg-1d-1)、中(50 mgkg-1d-1)、低(25mg kg-1 d-1)二氧化硫衍生物混合液染毒组、高剂量二氧化硫衍生物混合液+N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)染毒组及生理盐水对照组(0.9%氯化钠注射液)。各组均以 2 mL kg-1每日行腹腔注射一次,高剂量+NAC 组每次腹腔注射前 30 min予 200 mg kg-1NAC 水溶液灌胃再施予高剂量组相同染毒操作,连续 4 周。取大鼠下颌骨切牙组织进行超氧化物歧化酶(su-peroxide dismutase,
5、SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平测定。剥离包绕切牙根部的下颌骨分离成釉器细胞,以 Western blot 法检测成釉器细胞 MAPKs 信号通路关键蛋白及 AE2 蛋白表达情况。结果显示,低剂量染毒组与对照组比较,大鼠切牙组织多类抗氧化指标及过氧化产物含量的改变均不具统计学意义。中、高剂量染毒组较对照组大鼠切牙组织 SOD 活性、GSH-
6、Px 活性及 GSH 含量下降、MDA、ROS 水平升高,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot 结果显示,随二氧化硫衍生物剂量升高,各组大鼠成釉器细胞 p-p38 MAPK/p38 MAPK 及 p-ERK/ERK 水平较对照组未见明显变化,而中、高剂量组 p-JNK/JNK 水平明显升高,AP-1 蛋白发生核转位分布,AE2 蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P0.05);而 ROS 抑制剂 NAC 能使高剂量下 AP-1 蛋白核转位情况得到改善,并能在一定程度上逆转高剂量二氧化硫衍生物暴露下引起的 p-JNK/JNK 水平升高及 AE2 蛋白表达上调。以上结果提示,
7、二氧化硫体内衍生物混合液可造成大鼠切牙组织氧化应激水平升高并通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导切牙成釉细胞 AE2 表达上调,具有干扰成釉器细胞成釉功能的潜在毒性。关键词:二氧化硫体内衍生物;成釉器细胞;氧化应激;丝裂原活化蛋白激酶;激活蛋白-1;阴离子交换蛋白 2文章编号:1673-5897(2022)6-256-10 中图分类号:X171.5 文献标识码:AInternal Derivatives of Sulfur Dioxide Induced Up-regulation of AE2 Pro-tein Expression of Rat Enamel Organ through
8、 ROS/JNK/AP-1 PathwayRen Hongyue1,2,Yang Jin1,2,Liu Xia1,2,Yao Jie1,2,Lin Changhu1,Tu Chenglong1,2,3,*1.School of Public Health,Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China2.Key Laboratory of Environmental Pollution Monitoring and Disease Control,Ministry of Education,Guizhou Medical University,第
9、 6 期任洪玥等:二氧化硫体内衍生物通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导大鼠切牙成釉器细胞 AE2 蛋白表达上调257 Guiyang 550025,China3.Toxicity Testing Center of Guizhou Medical University,Guiyang 550025,ChinaReceived 10 January 2022 accepted 21 February 2022Abstract:To investigate the effects of sulfur dioxide derivative mixture(molar ratio of sodi
10、um sulfite to sodiumbisulfite is 31)on antioxidant defense system and expression of key proteins in mitogen-activated protein kinasesignal transduction pathway and anion exchanger protein 2(AE2)in enamel organ of incisors of male rats.Thirtymale Wistar rats were randomly divided into high(100 mg kg-
11、1d-1),medium(50 mgkg-1d-1),low(25 mgkg-1d-1)sulfur dioxide derivative mixture group,high-dose sulfur dioxide derivative mixture+N-acetylcysteine(NAC)group and normal saline control group(0.9%sodium chloride injection).Each group received intraperitone-al injection every day with a volume of 2 mL kg-
12、1for four weeks.The high-dose+NAC group was given 200 mg kg-1NAC solution 30 min before each intraperitoneal injection.The activities of superoxide dismutase(SOD)andglutathione peroxidase(GSH-Px),contents of reduced glutathione(GSH)and malondialdehyde(MDA),and levelsof reactive oxygen species(ROS)of
13、 incisors tissue were determined by assay kit.The enamel organ was separatedfrom the root of the incisor,and the expression of key proteins in mitogen-activated protein kinase signal transduc-tion pathway and AE2 of enamel organ was determined by Western blot.The results showed that compared withthe
14、 control group,there was no statistical significance in the changes of antioxidant indexes and content of peroxideproducts in the incisor tissue of rats in the low-dose group,while SOD activity,GSH-Px activity and GSH contentin the incisor tissue of rats in the medium-dose group and the high-dose gr
15、oup were decreased and level of MDAand ROS were increased.The difference was statistically significant(P0.05).As for the protein expression,West-ern blot results showed that with the increase of sulfur dioxide derivative dose,the levels of p-p38 MAPK/p38MAPK and p-ERK/ERK did not change significantl
16、y in each group compared with the control group,while thelevels of p-JNK/JNK in medium and high-dose groups increased significantly and expression of AE2 protein in-creased with nuclear translocation distribution of AP-1 protein occurred(P0.05).NAC,a ROS inhibitor can im-prove the nuclear translocat
17、ion of AP-1 protein and partly reverse the elevated p-JNK/JNK level and the up-regula-tion of AE2 protein expression induced by exposure to high dose of sulfur dioxide derivatives.These results sug-gest that mixture of sulfur dioxide derivatives can increase the oxidative stress level and induce the
18、 up-regulation ofAE2 expression of enamel organ of rat incisors through ROS/JNK/AP-1 pathway,which has the potential toxicityof interfering with the amelogenesis function of ameloblasts.Keywords:sulfur dioxide derivatives;enamel organ;oxidative stress;mitogen activated protein kinase;activatorprotei
19、n-1;anion exchanger 2 成釉器细胞包括内釉上皮细胞、星网状细胞、中间层细胞、外釉上皮细胞及成釉细胞,它们在功能上相互诱导、相互协同,在牙齿发育过程中发挥分泌基质、促进无机离子沉积、诱导晶体成核与矿化等作用,是形成牙体主要硬组织结构 牙釉质的关键细胞群1。釉质晶体的成核与生长是一个受到釉质基质 pH 影响的过程,离不开成釉器细胞对胞内外酸碱状态的精密调控,涉及多种离子转运体。其中,溶质载体家族 4(solute carrier 4,SLC4)的阴离子交换体2(anion exchanger 2,AE2)位于成釉细胞外侧基底部,可交换 Cl-与 HCO-3以调控釉质基质与成釉细
20、胞内的酸碱状态,在釉质矿化过程中发挥重要作用2-3。干扰上述牙源性细胞生理功能及成釉过程的各种因素,都有可能影响牙齿的正常发育,产生不良后果。目前认为,牙胚发育过程中持续过量地氟摄入是导致釉质发育障碍引起氟斑牙发生的根本原因,但具体发病机制尚不完全清楚4。自由基学说提出,高生物活性的氟化物对成釉细胞抗氧化防御系统的破坏是导致“氟斑牙”呈现釉基质蛋白滞留与釉质矿化不全的关键机制之一5-8。而值得注意的是,在我国西南部“燃煤型氟斑牙”病区环境中常合并高硫煤系分布,敞炉燃煤致居室内空气污染易出现超国家限量浓度的 SO2与含氟烟气并存的情况。早前有相关研究就该现象进行了动物实验研究,发258 生态毒理
21、学报第 17 卷现相较于二者单独染毒,同时接触大剂量氟化物与SO2烟气时大鼠氟斑牙患病程度更严重,提示 SO2对氟致氟斑牙的过程可能起到加强作用9;再有,SO2与氟化物共同暴露时将对雄性大鼠肾及睾丸组织产生更严重的损伤10-11,更加说明 SO2的存在将使氟化物产生更复杂的毒性效应。但以上研究均未就 SO2在“氟硫联合”过程中发挥毒作用所涉及的可能机制进行讨论。而除了对呼吸系统造成损害外,SO2还可影响多脏器的生理功能,是一种具有多种毒作用的全身性毒物。SO2经呼吸道吸收入血后在血液微碱性的环境中即转变为其衍生物 亚硫酸盐和亚硫酸氢盐(物质的量比约为 31),以其衍生物的形式随血液循环至全身,
22、对体内组织细胞产生毒作用12。降低体内抗氧化物质水平、削弱体内抗氧化防御系统是 SO2发挥毒作用的关键环节13。因此,本研究以氧化应激为切入点,探讨 SO2体内衍生物对大鼠切牙组织抗氧化防御系统及成釉器细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein ki-nases,MAPKs)信号转导通路关键蛋白与 AE2 蛋白表达的影响,探究其对牙齿发育相关生理过程的潜在毒性及可能机制,为后续深入“氟硫联合”过程中SO2毒作用的毒理学研究提供实验资料。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 实验动物分组及处理本研究采用 SPF 级雄性 4 周龄 Wi
23、star 大鼠,体质量 100 120 g,购于长沙市天勤生物技术有限公司,动物许可证编号:SCXK(湘)2019-0013。适应性饲养 1 周后按体质量随机分 5 组,即高、中、低二氧化硫衍生物混合液染毒组、生理盐水对照组、高剂量二氧化硫衍生物混合液+抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)拮抗组,染毒剂量分别为100mg kg-1 d-1(1/10LD50)、50 mg kg-1 d-1(1/20LD50)和25 mg kg-1 d-1(1/40LD50),对照组予 0.9%氯化钠注射液,高剂量+NAC 组每次腹腔注射前 30 min 予200 mg kg-1
24、NAC 水溶液灌胃,后与高剂量染毒组进行相同操作,各染毒组均于每日上午 9:00 行腹腔注射一次,给药容积为 2 mLkg-1,连续 4 周。饲养期间动物自由饮水、摄食,环境温度为(222),光照明暗各 12 h,相对湿度为(5010)%。末次给药后禁食 24 h,取相应生物样本进行实验。1.2 主要试剂亚硫酸钠(Na2SO3)、亚硫酸氢钠(NaHSO3)分析纯,购自美国 Sigma 公司,N-乙酰半胱氨酸购自美国 Sigma 公司,超氧化物歧化酶(superoxide dis-mutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione per-oxidase,GSH-Px)、丙二醛(
25、malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)检测试剂盒购自南京建成生物有限公司,大鼠活性氧簇(reac-tive oxygen species,ROS)Elisa 测定试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司,AE2 兔抗大鼠多克隆抗体购自美国 Invitrogen 公司,p38 MAPK 兔抗大鼠单克隆抗体、p-p38 MAPK 兔抗大鼠单克隆抗体、SAPK/JNK 兔抗大鼠多克隆抗体、p-SAPK/JNK 兔抗大鼠单克隆抗体、ERK1/2 兔抗大鼠多克隆抗体、p-ERK1/2 兔抗大鼠多克隆抗体购自美国 Cell Signaling
26、Tech-nology 公司,Histone H3 兔抗大鼠单克隆抗体购自美国 Santa Cruz 公司,辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 二抗购自北京爱必信生物技术有限公司。二氧化硫体内衍生物混合液的制备。取适量亚硫酸钠与亚硫酸氢钠,以 3 1 的物质的量比溶于0.9%生理盐水,每日新鲜配制。1.3 大鼠切牙组织氧化应激相关指标测定完整分离大鼠双侧下颌骨及切牙组织,取其中一侧用纱布仔细去除包绕的肌肉及结缔组织后置液氮中研磨成骨粉,并于组织破碎仪中进一步粉碎。取适量骨粉按 19 的质量体积比加入预冷的 0.9%生理盐水制成 10%组织匀浆,蛋白含量的测定采用BCA 法。按不同测定指标的样品
27、前处理要求离心后取上清液,依试剂盒说明书检测切牙组织中MDA、GSH 水平及 SOD、GSH-Px 活性。1.4 切牙组织 ROS 水平测定骨粉的制备同 1.3,取适量骨粉按 19 的质量体积比加入预冷的 PBS(0.01 mol L-1,pH=7.4),冰上充分研磨混匀制成切牙组织匀浆液,5 000g,离心10 min,取上清液按照试剂盒说明书测定切牙组织ROS 水平。1.5 Western blot 法测定大鼠成釉器细胞 MAPKs/AP-1 信号通路相关蛋白及 AE2 蛋白表达水平 取前述待用的另一侧大鼠切牙组织,参考Houari 等14的处理方法,仔细拨开包绕切牙根部的下颌骨,分离出成
28、釉细胞组织,用含 PMSF 的 RIPA裂解液 4 匀浆,冰上裂解 15 min 提取总蛋白,用BCA 试剂盒进行蛋白定量,分子量为 30 160 kD与 12 60 kD 的蛋白分别选用 8%或 12%SDS-PAGE 分离胶进行电泳分离,转膜后 5%脱脂牛奶室第 6 期任洪玥等:二氧化硫体内衍生物通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导大鼠切牙成釉器细胞 AE2 蛋白表达上调259 温封闭 1 h,磷酸化蛋白用 5%BSA 封闭液封闭 1h,分别加入适量 AE2 抗体(11 000)、p38 MAPK 抗体(1 1 000)、p-p38 MAPK 抗体(1 1 000)、SAPK/JNK
29、抗体(1 1 000)、p-SAPK/JNK 抗体(1 1 000)、ERK1/2 抗体(1 1 000)、p-ERK1/2 抗体(1 1 000)及-actin 抗体(12 000)4 摇床孵育过夜,TBST 洗膜 10 min 共 3 次,1 4 000 倍稀释二抗室温孵育 2h,TBST 洗膜10 min 共3 次,ECL 显色液显影,凝胶成像系统扫描并检测蛋白条带密度。1.6 统计学分析数据用均数标准差(xs)表示。统计学分析采用 SPSS 22.0 软件进行,多组间统计量的比较先进行方差齐性检验和单因素方差分析(one way-ANO-VA)。组间两两比较方差齐时用 Bonferro
30、ni 法,方差不齐时用 Dunnett s-t 检验,均采用双侧检验,P0.05 表示差异有统计学意义。2 结果(Results)2.1 二氧化硫体内衍生物混合液对大鼠切牙组织抗氧化防御系统的影响 与对照组比较,中、高剂量组大鼠切牙组织SOD、GSH-Px 活性和 GSH 水平下降,差异具有统计学意义(P0.05);MDA、ROS 水平升高(P0.05)。与高剂量组比较,高剂量+NAC 组 SOD 和 GSH-Px活性升高,GSH 水平上升,MDA、ROS 含量下降,差异有统计学意义(P0.05),如表 1 所示。2.2 二氧化硫体内衍生物对大鼠成釉器细胞MAPKs/AP-1 信号通路相关蛋白
31、表达的影响 如图 1 所示,低、中、高剂量组及高剂量+NAC组大鼠成釉器细胞 p-p38 MAPK/p38 MAPK 及 p-ERK/ERK 改变较对照组均无显著差异。而低剂量组大鼠成釉器细胞 JNK 磷酸化水平改变较对照组无显著差异,中、高剂量组磷酸化 JNK/JNK 水平较对照组升高,差异有统计学意义(P0.05),且经趋势性检验,JNK 磷酸化水平升高趋势表现出二氧化硫衍生物染毒剂量依赖性(F=158.58,P0.05)。与高剂量组比较,高剂量+NAC 组磷酸化 JNK/JNK 水平显著降低(P0.05),差异有统计学意义。如图 2 所示,与对照组比较,中、高剂量组大鼠成釉器细胞胞浆中
32、c-Fos、c-Jun 蛋白水平较对照组明显下降(P0.05),核内 c-Fos、c-Jun 蛋白水平明显上升(P0.05),提示高剂量组 AP-1 蛋白发生核转位。而高剂量+NAC 组 AP-1 蛋白核转位较高剂量组显著减少(P0.05),差异有统计学意义。低剂量组较对照组核内 c-Fos 蛋白水平升高,但总体 AP-1蛋白核浆分布改变无明显差异。表 1 二氧化硫体内衍生物对大鼠切牙组织抗氧化防御系统相关指标的影响(xs,n=6)Table 1 Effects of sulfur dioxide derivatives on indexes of antioxidant defense sy
33、stemof rat incisor tissue(xs,n=6)组别GroupsSOD 活性/(U mg-1)SOD activity/(U mg-1)GSH-Px 活性/(U mg-1)GSH-Px activity/(U mg-1)GSH 水平/(mol g-1)Level of GSH/(mol g-1)MDA 水平/(nmol mg-1)Level of MDA/(nmol mg-1)ROS 水平/(U mL-1)Level of ROS/(U mL-1)对照 Control150.2111.15128.936.6449.474.343.490.9129.312.26低剂量(25 m
34、g kg-1 d-1)Low-dose(25 mg kg-1 d-1)133.7611.91126.316.5348.743.993.060.9929.472.37中剂量(50 mg kg-1 d-1)Medium-dose(50 mg kg-1 d-1)92.1811.83a86.895.01a35.574.27a10.180.92a38.912.32a高剂量(100 mg kg-1 d-1)High-dose(100 mg kg-1 d-1)62.788.90a65.994.86a18.563.63a17.251.18a50.482.94a高剂量(100 mg kg-1 d-1)+NAC(
35、200 mg kg-1 d-1)High-dose(100 mg kg-1 d-1)+NAC(200 mg kg-1 d-1)161.4819.46b133.258.71b46.675.55b3.381.13b31.464.19b注:SOD 表示超氧化物歧化酶,GSH-Px 表示谷胱甘肽过氧化物酶,GSH 表示还原型谷胱甘肽,MDA 表示丙二醛,ROS 表示活性氧簇;NAC 表示 N-乙酰半胱氨酸;a与对照组比较,P0.05;b与高剂量组(100 mg kg-1)比较,P0.05。Note:SOD stands for superoxide dismutase;GSH-Px stands fo
36、r glutathione peroxidase;GSH stands for reduced glutathione;MDA stands for malondialde-hyde;ROS stands for reactive oxygen species;NAC stands for N-acetylcysteine;aP0.05 vs control group;bP0.05 vs high-dose group(100 mg kg-1).260 生态毒理学报第 17 卷图 1 二氧化硫体内衍生物对大鼠切牙成釉器细胞 MAPKs 信号通路关键蛋白表达的影响注:(a)MAPKs 信号通路
37、关键蛋白蛋白免疫印迹条带;(b)成釉器细胞 MAPKs 信号通路关键蛋白相对表达水平;A 对照组,B 高剂量组,C 中剂量组,D 低剂量组,E 高剂量+NAC 组;与对照组比较,#P0.05;与高剂量组比较,*P0.05;n=3。Fig.1 Effects of sulfur dioxide derivatives on expression of key proteins in MAPKs signaling pathwayof rat incisor enamel organ cellsNote:(a)Immunoblotting bands of key proteins in MAPK
38、s signaling pathway;(b)Relative expression of key proteins in MAPKssignaling pathway;A means control group,B means high-dose group,C means medium-dose group,D means low-dose group,and E means high dose+NAC group;#P0.05 vs control group;*P0.05 vs high-dose group;n=3.2.3 二氧化硫体内衍生物对大鼠成釉器细胞 AE2蛋白表达水平的影响
39、如图 3 所示,中、高剂量组 AE2 蛋白表达较对照组升高,差异有统计学意义(P0.05),且经趋势性检验,升高趋势表现出二氧化硫衍生物染毒剂量依赖性(F=530.167,P0.05)。与高剂量组比较,高剂量+NAC 组 AE2 蛋白表达水平显著降低(P0.05),差异有统计学意义。3 讨论(Discussion)机体内抗氧化防御系统主要由抗氧化酶类和抗氧化剂构成,它们之间相互协同、相互代偿共同发挥维持机体氧化与抗氧化动态平衡的作用。体内氧化与抗氧化之间的平衡状态被打破可诱导产生各种自由基引起组织氧化损伤,导致细胞功能异常甚至凋亡,从而对多种脏器造成损害15。已有多项研究表明,二氧化硫及其衍生
40、物可引起大、小鼠脑、肺、心、第 6 期任洪玥等:二氧化硫体内衍生物通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导大鼠切牙成釉器细胞 AE2 蛋白表达上调261 图 2 二氧化硫体内衍生物对大鼠切牙成釉器细胞胞质及胞核中 c-Fos 与 c-Jun 蛋白表达的影响注:(a)胞质中 c-Fos 与 c-Jun 蛋白相对表达水平;(b)胞核中 c-Fos 与 c-Jun 蛋白相对表达水平;A 对照组,B 高剂量组,C 中剂量组,D 低剂量组,E 高剂量+NAC 组;与对照组比较,#P0.05;与高剂量组比较,*P0.05;n=3。Fig.2 Effects of sulfur dioxide deriva
41、tives on expression of c-Fos and c-Jun protein in cytoplasmand nucleus of rat incisor enamel organ cellsNote:(a)Relative expression of c-Fos and c-Jun protein in cytoplasm;(b)Relative expression of c-Fos and c-Jun protein in nucleus;A means control group,B means high-dose group,C means medium-dose g
42、roup,D means low-dose group,and E means highdose+NAC group;#P0.05 vs control group;*P0.05 vs high-dose group;n=3.肝、脾、肾、胃、肠和睾丸等组织抗氧化物质含量减少,SOD、GSH-Px 和过氧化氢酶(catalase,CAT)等抗氧化酶活性改变,脂质过氧化产物含量增加16-19。可见,降低体内抗氧化物质水平、削弱体内抗氧化防御系统是二氧化硫及其衍生物发挥毒作用的关键环节之一。基于此,本研究通过亚急性腹腔注射二氧化硫体内衍生物构建动物染毒模型,观察二氧化硫衍生物对大鼠切牙组织抗氧化防御
43、系统的影响。结果显示,相较于对照组,中、高剂量染毒组大鼠切牙组织 GSH 含量、SOD 活性和 GSH-Px 活性下降,同时,脂质过氧化产物 MDA、ROS 水平显著上升,而预先给予活性氧抑制剂 NAC 再予高剂量二氧化硫衍生物时,大鼠切牙组织抗氧化防御系统各项指标均较单独施予高剂量二氧化硫衍生物而言有了明显改善,表明二氧化硫体内衍生物可引起切牙组织细胞抗氧化防御系统紊乱,活性氧自由基蓄积,这与其他学者在大鼠心、肝、肺和肾等主要脏器组织中观察到的结果类似。262 生态毒理学报第 17 卷图 3 二氧化硫体内衍生物对大鼠切牙成釉器细胞 AE2 蛋白表达的影响注:A 对照组,B 高剂量组,C 中剂
44、量组,D 低剂量组,E 高剂量+NAC 组;与对照组比较,#P0.05;与高剂量组比较,*P0.05;n=3。Fig.3 Effect of sulfur dioxide derivatives on the expressionof AE2 protein in incisor enamel organ of ratsNote:A means control group,B means high-dose group,C means medium-dose group,D means low-dose group,and E means high dose+NAC group;#P0.05
45、vs control group;*P0.05 vs high-dose group;n=3.氧化应激导致活性氧簇的大量积累可激活多种信号转导途径,引起下游 NF-B、AP-1 等转录因子的活化而介导相关基因的表达改变20-22。广泛存在于组织细胞中的 MAPKs 信号转导途径可被紫外线、炎性细胞因子和 ROS 等胞外刺激激活,参与胞外刺激向细胞内传递的过程,在触发细胞生物化学变化相关靶基因表达的过程中发挥重要作用,主要涉及 3 种激酶的活化:p38 MAPK、ERK1/2 和 JNK。核转录因子 AP-1(activator protein 1,AP-1)是由 c-Jun 和 c-Fos 构
46、 成 的 一 类 转 录 激 活 因 子,作 为MAPKs 信号通路的下游分子,在接受自胞外逐渐传递入胞的信号后,即从胞质进入细胞核,与多种基因的 DNA 调节序列相结合,调控相应基因的表达,进而参与细胞炎性反应、分化和凋亡等多种细胞过程。有研究指出,氧化应激可通过诱导核转录因子 AP-1活化,介导呼吸道上皮细胞 AE2 的表达上调,通过阻断 AE2 的功能可减轻肺缺血/再灌注损伤的程度23。另有研究发现,高糖引起的血管平滑肌内皮细胞凋亡与 AE2 表达上调及其功能激活进而诱导的线粒体氧化应激相关,AE2 的异常表达上调与功能激活可通过诱导胞内活性氧簇的大量产生,引起细胞凋亡等不良结局的发生2
47、4-25。作为膜结合的Cl-/HCO-3交换蛋白,AE2 主要参与细胞内 pH 值(pHi)和离子平衡的调节,在成熟期,成釉细胞表达于基底侧部膜区26。根据 AE2 胞膜定位与功能特性,其交换 Cl-/HCO-3的作用被认为与成釉细胞内碳酸酐酶及顶端膜质子泵的功能相耦联,是成釉细胞顶端膜周期性的 H+分泌功能得以实现的关键26-27。同时,AE2 还起到向胞外排出 HCO-3中和釉质晶体生长所释放的大量质子以维持胞外釉质基质微环境酸碱平衡稳态的作用28。但 AE2 在排出HCO-3和泵入 Cl-时可使细胞酸化,也能够将细胞外的超氧阴离子自由基(O-2)交换至细胞内29。因此,当 AE2 被异常
48、激活时将会有大量的 O-2 和 Cl-由胞外被转移入胞内,可导致细胞酸化并引发胞内“呼吸爆发”,进而活化活性氧相关信号转导途径引起细胞功能改变或诱导细胞凋亡发生。AE2 的异常表达及活性改变可能是某些疾病状态发生的中间事件30-31,在一些肿瘤发生的过程中也观察到 AE2 蛋白高表达与疾病不良预后高度相关32-35。综合以上论述,细胞活性氧簇的大量产生与AE2 表达及功能之间应存在某种复杂关系,为此,本研究探讨了在随染毒剂量增加,氧化应激激活且AE2 蛋白表达升高的状态下,切牙成釉器细胞MAPKs 信号通路 3 种主要蛋白激酶的活化及 AP-1蛋白的核浆分布情况,实验结果显示,随着二氧化硫衍生
49、物剂量升高,p-p38 MAPK/p38 MAPK 及 p-ERK/ERK 水平较对照组未见明显变化,而 p-JNK/JNK 明显升高伴随着胞浆内 c-Fos、c-Jun 蛋白水平减少,核内 c-Fos、c-Jun 蛋白上升,提示 AP-1 蛋白发生核转位,ROS 抑制剂能在一定程度上逆转高剂量二氧化硫衍生物暴露下引起的 AE2 蛋白表达上调及 p-JNK/JNK 水平升高,AP-1 蛋白核转位情况亦有所改善。上述结果表明,二氧化硫衍生物可通过激活氧化应激并可能主要由 ROS/JNK/AP-1 信号通路诱导大鼠成釉器细胞 AE2 蛋白表达升高,具有对成釉器细胞的生理状态与功能产生不良影响的潜在
50、毒性,由此推测二氧化硫衍生物具有影响切牙细胞生理功能、干扰牙齿正常形成与发育的潜能。可能涉及以下关键环节:二氧化硫衍生物激活成釉器细胞氧化应激,通过活化 MAPKs/AP-1 等信号通路诱导 AE2 表达上调,使其交换细胞内外离子的功能在第 6 期任洪玥等:二氧化硫体内衍生物通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导大鼠切牙成釉器细胞 AE2 蛋白表达上调263 总体上得到增强,而细胞酸化与胞内氧化应激的进一步发展增大了细胞负荷,甚至可能引起细胞凋亡的发生;另外,AE2 表达上调与及功能激活使成釉细胞内外的离子稳态遭到破坏,与成釉细胞 AE2 的Cl-/HCO-3交换作用高度关联的顶端膜周期性
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