二氧化硫体内衍生物通过RO...釉器细胞AE2蛋白表达上调_任洪玥.pdf
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1、生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第 17 卷 第 6 期 2022 年 12 月Vol.17,No.6 Dec.2022 基金项目:国家自然科学基金资助项目(41967051,42167059)第一作者:任洪玥(1996),女,硕士研究生,研究方向为环境毒理学,E-mail: *通信作者(Corresponding author),E-mail:DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20220110001任洪玥,杨进,刘霞,等.二氧化硫体内衍生物通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导大鼠切牙成釉器细胞 AE2 蛋白表达上调J.生态毒理学报
2、,2022,17(6):256-265Ren H Y,Yang J,Liu X,et al.Internal derivatives of sulfur dioxide induced up-regulation of AE2 protein expression of rat enamel organ through ROS/JNK/AP-1 pathway J.Asian Journal of Ecotoxicology,2022,17(6):256-265(in Chinese)二氧化硫体内衍生物通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导大鼠切牙成釉器细胞 AE2 蛋白表达上调任洪玥1,2
3、,杨进1,2,刘霞1,2,姚杰1,2,林昌虎1,涂成龙1,2,3,*1.贵州医科大学公共卫生与健康学院,贵阳 5500252.贵州医科大学环境污染与疾病监控教育部重点实验室,贵阳 5500253.贵州医科大学毒性检测中心,贵阳 550025收稿日期:2022-01-10 录用日期:2022-02-21摘要:探究二氧化硫体内衍生物混合液(亚硫酸钠与亚硫酸氢钠物质的量比为 31)对雄性大鼠切牙组织抗氧化防御系统及切牙成釉器细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)信号转导通路关键蛋白与阴离子交换蛋白 2(ani-on exchanger
4、 2,AE2)表达的影响。30 只雄性 Wistar 大鼠按体质量随机分为高(100 mgkg-1d-1)、中(50 mgkg-1d-1)、低(25mg kg-1 d-1)二氧化硫衍生物混合液染毒组、高剂量二氧化硫衍生物混合液+N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)染毒组及生理盐水对照组(0.9%氯化钠注射液)。各组均以 2 mL kg-1每日行腹腔注射一次,高剂量+NAC 组每次腹腔注射前 30 min予 200 mg kg-1NAC 水溶液灌胃再施予高剂量组相同染毒操作,连续 4 周。取大鼠下颌骨切牙组织进行超氧化物歧化酶(su-peroxide dismutase,
5、SOD)活性、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)活性、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)及丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量、活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)水平测定。剥离包绕切牙根部的下颌骨分离成釉器细胞,以 Western blot 法检测成釉器细胞 MAPKs 信号通路关键蛋白及 AE2 蛋白表达情况。结果显示,低剂量染毒组与对照组比较,大鼠切牙组织多类抗氧化指标及过氧化产物含量的改变均不具统计学意义。中、高剂量染毒组较对照组大鼠切牙组织 SOD 活性、GSH-
6、Px 活性及 GSH 含量下降、MDA、ROS 水平升高,差异有统计学意义(P0.05)。Western blot 结果显示,随二氧化硫衍生物剂量升高,各组大鼠成釉器细胞 p-p38 MAPK/p38 MAPK 及 p-ERK/ERK 水平较对照组未见明显变化,而中、高剂量组 p-JNK/JNK 水平明显升高,AP-1 蛋白发生核转位分布,AE2 蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P0.05);而 ROS 抑制剂 NAC 能使高剂量下 AP-1 蛋白核转位情况得到改善,并能在一定程度上逆转高剂量二氧化硫衍生物暴露下引起的 p-JNK/JNK 水平升高及 AE2 蛋白表达上调。以上结果提示,
7、二氧化硫体内衍生物混合液可造成大鼠切牙组织氧化应激水平升高并通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导切牙成釉细胞 AE2 表达上调,具有干扰成釉器细胞成釉功能的潜在毒性。关键词:二氧化硫体内衍生物;成釉器细胞;氧化应激;丝裂原活化蛋白激酶;激活蛋白-1;阴离子交换蛋白 2文章编号:1673-5897(2022)6-256-10 中图分类号:X171.5 文献标识码:AInternal Derivatives of Sulfur Dioxide Induced Up-regulation of AE2 Pro-tein Expression of Rat Enamel Organ through
8、 ROS/JNK/AP-1 PathwayRen Hongyue1,2,Yang Jin1,2,Liu Xia1,2,Yao Jie1,2,Lin Changhu1,Tu Chenglong1,2,3,*1.School of Public Health,Guizhou Medical University,Guiyang 550025,China2.Key Laboratory of Environmental Pollution Monitoring and Disease Control,Ministry of Education,Guizhou Medical University,第
9、 6 期任洪玥等:二氧化硫体内衍生物通过 ROS/JNK/AP-1 通路诱导大鼠切牙成釉器细胞 AE2 蛋白表达上调257 Guiyang 550025,China3.Toxicity Testing Center of Guizhou Medical University,Guiyang 550025,ChinaReceived 10 January 2022 accepted 21 February 2022Abstract:To investigate the effects of sulfur dioxide derivative mixture(molar ratio of sodi
10、um sulfite to sodiumbisulfite is 31)on antioxidant defense system and expression of key proteins in mitogen-activated protein kinasesignal transduction pathway and anion exchanger protein 2(AE2)in enamel organ of incisors of male rats.Thirtymale Wistar rats were randomly divided into high(100 mg kg-
11、1d-1),medium(50 mgkg-1d-1),low(25 mgkg-1d-1)sulfur dioxide derivative mixture group,high-dose sulfur dioxide derivative mixture+N-acetylcysteine(NAC)group and normal saline control group(0.9%sodium chloride injection).Each group received intraperitone-al injection every day with a volume of 2 mL kg-
12、1for four weeks.The high-dose+NAC group was given 200 mg kg-1NAC solution 30 min before each intraperitoneal injection.The activities of superoxide dismutase(SOD)andglutathione peroxidase(GSH-Px),contents of reduced glutathione(GSH)and malondialdehyde(MDA),and levelsof reactive oxygen species(ROS)of
13、 incisors tissue were determined by assay kit.The enamel organ was separatedfrom the root of the incisor,and the expression of key proteins in mitogen-activated protein kinase signal transduc-tion pathway and AE2 of enamel organ was determined by Western blot.The results showed that compared withthe
14、 control group,there was no statistical significance in the changes of antioxidant indexes and content of peroxideproducts in the incisor tissue of rats in the low-dose group,while SOD activity,GSH-Px activity and GSH contentin the incisor tissue of rats in the medium-dose group and the high-dose gr
15、oup were decreased and level of MDAand ROS were increased.The difference was statistically significant(P0.05).As for the protein expression,West-ern blot results showed that with the increase of sulfur dioxide derivative dose,the levels of p-p38 MAPK/p38MAPK and p-ERK/ERK did not change significantl
16、y in each group compared with the control group,while thelevels of p-JNK/JNK in medium and high-dose groups increased significantly and expression of AE2 protein in-creased with nuclear translocation distribution of AP-1 protein occurred(P0.05).NAC,a ROS inhibitor can im-prove the nuclear translocat
17、ion of AP-1 protein and partly reverse the elevated p-JNK/JNK level and the up-regula-tion of AE2 protein expression induced by exposure to high dose of sulfur dioxide derivatives.These results sug-gest that mixture of sulfur dioxide derivatives can increase the oxidative stress level and induce the
18、 up-regulation ofAE2 expression of enamel organ of rat incisors through ROS/JNK/AP-1 pathway,which has the potential toxicityof interfering with the amelogenesis function of ameloblasts.Keywords:sulfur dioxide derivatives;enamel organ;oxidative stress;mitogen activated protein kinase;activatorprotei
19、n-1;anion exchanger 2 成釉器细胞包括内釉上皮细胞、星网状细胞、中间层细胞、外釉上皮细胞及成釉细胞,它们在功能上相互诱导、相互协同,在牙齿发育过程中发挥分泌基质、促进无机离子沉积、诱导晶体成核与矿化等作用,是形成牙体主要硬组织结构 牙釉质的关键细胞群1。釉质晶体的成核与生长是一个受到釉质基质 pH 影响的过程,离不开成釉器细胞对胞内外酸碱状态的精密调控,涉及多种离子转运体。其中,溶质载体家族 4(solute carrier 4,SLC4)的阴离子交换体2(anion exchanger 2,AE2)位于成釉细胞外侧基底部,可交换 Cl-与 HCO-3以调控釉质基质与成釉细
20、胞内的酸碱状态,在釉质矿化过程中发挥重要作用2-3。干扰上述牙源性细胞生理功能及成釉过程的各种因素,都有可能影响牙齿的正常发育,产生不良后果。目前认为,牙胚发育过程中持续过量地氟摄入是导致釉质发育障碍引起氟斑牙发生的根本原因,但具体发病机制尚不完全清楚4。自由基学说提出,高生物活性的氟化物对成釉细胞抗氧化防御系统的破坏是导致“氟斑牙”呈现釉基质蛋白滞留与釉质矿化不全的关键机制之一5-8。而值得注意的是,在我国西南部“燃煤型氟斑牙”病区环境中常合并高硫煤系分布,敞炉燃煤致居室内空气污染易出现超国家限量浓度的 SO2与含氟烟气并存的情况。早前有相关研究就该现象进行了动物实验研究,发258 生态毒理
21、学报第 17 卷现相较于二者单独染毒,同时接触大剂量氟化物与SO2烟气时大鼠氟斑牙患病程度更严重,提示 SO2对氟致氟斑牙的过程可能起到加强作用9;再有,SO2与氟化物共同暴露时将对雄性大鼠肾及睾丸组织产生更严重的损伤10-11,更加说明 SO2的存在将使氟化物产生更复杂的毒性效应。但以上研究均未就 SO2在“氟硫联合”过程中发挥毒作用所涉及的可能机制进行讨论。而除了对呼吸系统造成损害外,SO2还可影响多脏器的生理功能,是一种具有多种毒作用的全身性毒物。SO2经呼吸道吸收入血后在血液微碱性的环境中即转变为其衍生物 亚硫酸盐和亚硫酸氢盐(物质的量比约为 31),以其衍生物的形式随血液循环至全身,
22、对体内组织细胞产生毒作用12。降低体内抗氧化物质水平、削弱体内抗氧化防御系统是 SO2发挥毒作用的关键环节13。因此,本研究以氧化应激为切入点,探讨 SO2体内衍生物对大鼠切牙组织抗氧化防御系统及成釉器细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein ki-nases,MAPKs)信号转导通路关键蛋白与 AE2 蛋白表达的影响,探究其对牙齿发育相关生理过程的潜在毒性及可能机制,为后续深入“氟硫联合”过程中SO2毒作用的毒理学研究提供实验资料。1 材料与方法(Materials and methods)1.1 实验动物分组及处理本研究采用 SPF 级雄性 4 周龄 Wi
23、star 大鼠,体质量 100 120 g,购于长沙市天勤生物技术有限公司,动物许可证编号:SCXK(湘)2019-0013。适应性饲养 1 周后按体质量随机分 5 组,即高、中、低二氧化硫衍生物混合液染毒组、生理盐水对照组、高剂量二氧化硫衍生物混合液+抗氧化剂 N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine,NAC)拮抗组,染毒剂量分别为100mg kg-1 d-1(1/10LD50)、50 mg kg-1 d-1(1/20LD50)和25 mg kg-1 d-1(1/40LD50),对照组予 0.9%氯化钠注射液,高剂量+NAC 组每次腹腔注射前 30 min 予200 mg kg-1
24、NAC 水溶液灌胃,后与高剂量染毒组进行相同操作,各染毒组均于每日上午 9:00 行腹腔注射一次,给药容积为 2 mLkg-1,连续 4 周。饲养期间动物自由饮水、摄食,环境温度为(222),光照明暗各 12 h,相对湿度为(5010)%。末次给药后禁食 24 h,取相应生物样本进行实验。1.2 主要试剂亚硫酸钠(Na2SO3)、亚硫酸氢钠(NaHSO3)分析纯,购自美国 Sigma 公司,N-乙酰半胱氨酸购自美国 Sigma 公司,超氧化物歧化酶(superoxide dis-mutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione per-oxidase,GSH-Px)、丙二醛(
25、malondialdehyde,MDA)、还原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)检测试剂盒购自南京建成生物有限公司,大鼠活性氧簇(reac-tive oxygen species,ROS)Elisa 测定试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司,AE2 兔抗大鼠多克隆抗体购自美国 Invitrogen 公司,p38 MAPK 兔抗大鼠单克隆抗体、p-p38 MAPK 兔抗大鼠单克隆抗体、SAPK/JNK 兔抗大鼠多克隆抗体、p-SAPK/JNK 兔抗大鼠单克隆抗体、ERK1/2 兔抗大鼠多克隆抗体、p-ERK1/2 兔抗大鼠多克隆抗体购自美国 Cell Signaling
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