1、基础研究中国民间疗法 C H I N A SN A T U R O P A T H Y,J u l.2 0 2 3,V o l.3 1N o.1 4 基金项目:山西省应用基础研究计划(2 0 1 9 0 1 D 2 1 1 5 2 6)作者:平高华,E-m a i l:l f f 1 7 1 2 9 0 6 4 2 2 6 2 0 2 21 6 3.c o m复方蛇龙胶囊对链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠肾组织P I 3 K A k t m T O R信号通路及P T E N的影响平高华(山西省中医院,山西 太原0 3 0 0 1 2)【摘要】目的:探讨复方蛇龙胶囊对链脲佐菌素(S T Z)诱导
2、的糖尿病肾病(D N)大鼠肾组织磷脂酰肌醇3-激酶(P I 3 K)/蛋白激酶(A k t)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTO R)信号通路及第1 0号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(P T E N)的影响。方法:从4 0只雄性S P F级健康W i s t a r大鼠中随机选取8只作为对照组,其余大鼠建立D N模型,将3 0只建模成功大鼠随机分为模型组、氯沙坦组和复方蛇龙胶囊组,每组1 0只。氯沙坦组给予氯沙坦1 0m g/k g灌胃,复方蛇龙胶囊组给予复方蛇龙胶囊3.5 6g/k g灌胃,对照组与模型组均给予等量的0.9%氯化钠溶液灌胃。连续给药6周后,检测4组大鼠尿素氮(B UN)水
3、平,观察肾脏组织中P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白及mR NA表达情况。结果:与对照组比较,模型组、氯沙坦组及复方蛇龙胶囊组B UN水平均升高(P0.0 5),P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量及P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N mR NA表达量均上升(P0.0 5)。与模型组比较,氯沙坦组、复方蛇龙胶囊组B UN水平均降低(P0.0 5),P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量及P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N mR NA表达量
4、均降低(P0.0 5)。与氯沙坦组比较,复方蛇龙胶囊组B UN水平降低(P0.0 5),P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量及P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N mR NA表达量均降低(P3.0时,D N大鼠模型成功5。建模过程中两只大鼠造模失败,其余造模成功大鼠随机分为模型组、氯 沙 坦 组 及 复 方 蛇 龙 胶 囊 组,每 组1 0只。(2)药物处理 各组实验用药经0.9%氯化钠溶液配置成混悬液,充分摇匀后灌胃。对照组与模型组给予等量的0.9%氯化钠溶液灌胃,氯沙坦组给予氯沙坦1 0m g/k g灌胃,复方蛇龙胶囊组给予3.
5、5 6g/k g复方蛇龙胶囊灌胃,每天1次,连续给药6周。给药剂量根据人与大鼠的体表面积公式进行换算6。(3)大鼠B UN测定 给药结束后,所有大鼠均一次性给予2%戊巴比妥钠4 0m g/k g腹腔注射,1 0m i n后观察大鼠进行麻醉状态后采集眼眶静脉血0.5m L,按35 0 0r/m i n(离心半径1 0c m)离心1 0m i n后取上清液,采用全自动生化分析仪,根据酶联免疫试剂盒说明书检测大鼠B UN水平。(4)大鼠肾脏P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量 血液采集完毕后迅速处死所有大鼠,取出肾脏,置于液氮中冷冻保存。取1 0 0m g冷冻保存
6、的肾脏组织,研磨成匀浆,对肾脏组织细胞进行裂解处理,测定总蛋白含量,电泳分离目的蛋白质,转膜,封闭,分别加入P I 3 K、p-A k t、m T O R、p-P T E N及内参兔抗大鼠一抗、山羊抗兔二抗,孵育后显影、定影,得到结果。目的蛋白表达量=目的蛋白的吸光度值/G A P D H的吸光度值7。(5)大鼠肾脏P I 3 K、p-A k t、m T O R、p-P T E Nm R N A表达量 取1 0 0m g冷冻保存的肾脏组织,根据T R I z o l试剂盒说明书提取大鼠肾脏总R NA,并进行总R NA浓度检测,以总R NA为模板,进行逆转录实验,最终得到c R NA。根据QT
7、R-P C R试剂盒,配置2 0L的反应体系,其中包括c D NA2L,上、下游引物各1L,S Y B R2L,加入纯水补足至2 0L。扩增条件:9 5预变性3 0s,9 5变性1 0s,6 2退火3 4s,7 2延伸3 0s,4 0次 循 环。以GA P DH为 内 参,引 物 序 列 见表1。表1 糖尿病肾病大鼠肾脏各基因P C R引物序列基因引物序列P I 3 KF o r w a r d:5 -GAA C AGAT AG G C AA C G GA-3 R e v e r s e:5 -C G T C A GA C C AAGAAG C TA-3 A k tF o r w a r d:
8、5 -TA C G G C T GAT C C TAA C AT G G-3 R e v e r s e:5 -AT G T A C G C T C T A C G G T G T C A-3 mTORF o r w a r d:5 -C T C GAT G T C C A C T C G C C TA C-3 R e v e r s e:5 -A C C TA C C G C AA C GAT G C T T-3 P T E NF o r w a r d:5 -A C AT A C G G C GA C AA C AG GA C-3 R e v e r s e:5 -T G C AT C A
9、AT G T C G C T TA T C C C-3 GA P DHF o r w a r d:5 -C AG C AG T GA C AT G C A C T GA-3 R e v e r s e:5 -G C T G G C AA C T AT TAA G GAG-3 1.4 统计学方法 采用S P S S2 2.0统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料以均数标准差(xs)表示,多组均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用L S D-t检验。P0.0 5为差异有统计学意义。2 结果2.1 B UN水平比较 与对照组比较,模型组、氯沙坦组及复方蛇龙胶囊组B UN水平均升高(P0.0 5)
10、。与模型组比较,氯沙坦组、复方蛇龙胶囊组B UN水平均降低(P0.0 5)。与氯沙坦组比较,复方蛇龙胶囊组B UN水平较低(P0.0 5)。见表1。表1 4组糖尿病肾病大鼠尿素氮水平比较(xs,m g/d L)组别例数尿素氮水平对照组86.8 71.2 8模型组1 01 9.6 85.8 2氯沙坦组1 09.3 52.3 3复方蛇龙胶囊组1 07.4 22.1 7*注:与对照 组比 较,P0.0 5;与模 型 组比 较,P0.0 5;与 氯 沙 坦 组 比较,*P0.0 5。77中国民间疗法2 0 2 3年7月第3 1卷第1 4期 基础研究中国民间疗法 C H I N A SN A T U R
11、 O P A T H Y,J u l.2 0 2 3,V o l.3 1N o.1 4 2.2 P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量比较与对照组比较,模型组、氯沙坦组及复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N蛋白表达量均上升(P0.0 5)。与模型组比较,氯沙坦组、复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N蛋白表达量均降低(P0.0 5)。与氯沙坦组比较,复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N蛋白表达量均降低(P0.0 5)。见表2。表2 4组糖尿病肾
12、病大鼠肾脏4种蛋白表达量比较(xs)组别例数P I 3 Kp-A k tmT ORp-P T E N对照组81.0 30.2 10.8 80.2 70.7 40.1 30.5 10.1 2模型组1 01.7 80.2 51.5 60.3 51.1 20.2 21.1 60.2 6氯沙坦组1 01.4 20.1 81.2 70.3 10.9 80.1 20.9 20.1 8复方蛇龙胶囊组1 01.2 10.1 5*1.1 40.2 6*0.8 50.1 5*0.7 40.1 5*注:1.与对照组比较,P0.0 5;与模型组比较,P0.0 5;与氯沙坦组比较,*P0.0 5。2.P I 3 K,磷
13、脂酰肌醇3-激酶;p-A k t,诱导磷酸化蛋白激酶;mTOR,雷帕霉素靶蛋白。2.3 P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N mR NA表达量比较 与对照组比较,模型组、氯沙坦组及复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N mR NA表达量均上升(P0.0 5)。与模型组比较,氯沙坦组、复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N mR NA表达量均降低(P0.0 5)。与氯沙坦组比较,复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N mR NA表达量均降低(P0.0 5)。
14、见表3。表3 4组糖尿病肾病大鼠肾脏4种蛋白m R N A表达量比较(xs)组别例数P I 3 K mRNAp-A k tmRNAmTOR mRNA p-P T E N mRNA对照组80.4 6 0.0 60.3 8 0.0 50.3 1 0.0 50.4 7 0.0 7模型组1 01.6 4 0.1 81.2 5 0.1 51.1 6 0.1 31.2 1 0.1 4氯沙坦组1 00.8 9 0.1 10.8 7 0.1 20.8 4 0.1 00.9 0 0.1 1复方蛇龙胶囊组1 00.6 2 0.0 8#0.6 6 0.0 7#0.5 6 0.0 7#0.6 7 0.0 9#注:1.
15、与对照组比较,P0.0 5;与模型组比较,P0.0 5;与氯沙坦组比较,#P0.0 5。2.P I 3 K,磷脂酰肌醇3-激酶;p-A k t,磷酸化蛋白激酶;mTO R,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白。3 讨论目前,D N以降糖、降血压为主要治疗方式,但预后较差,因此寻找新的治疗方式尤为重要。中医认为,D N病机复杂,以湿热证多见,多因激素治疗、中药温阳补气类药物单补不清所致,久病入络,导致血脉不通,形成瘀血。复方蛇龙胶囊以湿瘀互阻立论,具有清热渗湿、消肿散结、破血通经的功效。因此选用此药进行研究,探讨其治疗D N的作用机制。肾脏损伤与细胞自噬作用有关。齐宝宁等8研究表明,大黄素能下调m i R-2
16、 1的表达,促进D N小鼠细胞自噬作用,以减轻肾脏氧化性损伤。因此,笔者推测复方蛇龙胶囊对D N大鼠的作用效果可能与细胞 自噬有关。P I 3 K/A k t/mTO R通路是介导细胞信息传递的重要通路,参与炎性反应、细胞凋亡等生理过程的调控9。多项研究证实P T E N对于癌细胞增殖、迁移、凋亡等具有一定的调控作用1 0-1 1。目前,复方蛇龙胶囊调控P I 3 K/A k t/mTO R通路及P T E N的研究较少,本研究通过构建D N大鼠模型,探究复方蛇龙胶囊对肾脏P I 3 K/A k t/mTO R信号通路及P T E N的影响,为防治D N提供新思路。B UN是一种蛋白质代谢产物
17、,主要分布于血液中,由肾小球的滤过作用进入原尿,通常一半以上的B UN会通过肾小管重新吸收,但肾脏受损时,该吸收过程受到影响,血液中的B UN含量升高1 2。本研究结果显示,模型组B UN水平明显升高,表明D N会对肾脏造成一定的损伤,而氯沙坦组及复方蛇龙胶囊组B UN水平降低,提示两种药物对肾脏均有一定的保护作用。复方蛇龙胶囊中穿山龙具有抗炎、抗氧化及抗氧化应激的作用,有研究认为其活性成分可有效治疗糖尿病周围神经病变1 3。现代药理研究通过分子对接技术和体外细胞实验表明,穿山龙可有效改善肾功能指标如B UN,从而在肾病治疗中发挥效果1 4。鬼箭羽具有降糖、降脂作用,能够防止肾小球硬化,对肾脏
18、起到一定的保护作用1 5。白花蛇舌草具有抗肿瘤、抗氧化、调节机体免疫功能的作用,含有该药物的汤剂具有降低尿蛋白、降血脂、提高血清蛋白等作用,改善病理组织学变化,减轻肾脏损害1 6-1 7。在多种成分的共同作用下,复方蛇龙胶囊可降低大鼠B UN水平,起到保护肾脏的作用。P I 3 K/A k t/mTO R通路是机体重要的信号通路,参与 细 胞 凋 亡、炎 性 反 应 等 多 种 生 理 过 程。目 前P I 3 K/A k t信号通路已被证实是D N发病过程中重要的信号通路,与系膜基质增生、足细胞损伤等有密切联87 中国民间疗法2 0 2 3年7月第3 1卷第1 4期 基础研究中国民间疗法 C
19、 H I N A SN A T U R O P A T H Y,J u l.2 0 2 3,V o l.3 1N o.1 4系,参与D N肾脏损伤病理过程1 8。蛋白尿是D N的重要临床特征,肾脏病理检查可见肾小球、肾小管及肾间质病变,包括肾小球肥大、肾小管上皮细胞转分化、K-W结节等,P I 3 K/A k t信号通路抑制剂L Y 2 9 4 0 0 2的加入能够有效改善系膜增生等多种病理损伤,降低蛋白尿,提示P I 3 K/A k t信号通路可能是D N治疗的关键信 号 通 路1 9。本 研 究 结 果 显 示,模 型 组P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表
20、达量及mR NA表达量均上升,表明D N能够激活P I 3 K/A k t/mTO R通路,抑制肾脏的自噬保护途径,使肾脏受到损伤。氯沙坦组及复发蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量及mR NA表达量均下降,而复发蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、m T O R、p-P T E N蛋白表达量及m R N A表达量均低于氯沙坦组。说明上述两种药物治疗后,D N模型大鼠体内P I 3 K/A k t/mTO R通路的激活均受到抑制,而复发蛇龙胶囊的抑制作用优于氯沙坦,能更好地改善D N大鼠的肾脏受损情况。综上所述,复方蛇龙胶囊能够改善S T Z
21、诱导的D N大鼠的肾脏受损情况,其作用机制可能与P I 3 K/A k t/mTO R信号通路及P T E N有关。未来可对其他信号通路进行研究,以深入探究复方蛇龙胶囊治疗D N的作用机制。参考文献1 高丝娜,李英,迟雁青,等.白藜芦醇对糖尿病肾病小鼠肾脏氧化应激及肾组织N r f 2通路蛋白表达的影响J.山东医药,2 0 1 9,5 9(1 1):4 4-4 7,5 2.2 何康婧,高增平,王晓雪,等.基于P I 3 K/A k t/mTO R自噬信号通路研究雷公藤多苷片对糖尿病肾病大鼠肾脏损伤的保护作用J.中南药学,2 0 2 0,1 8(6):9 0 5-9 0 9.3 庞欣欣,石秀杰,
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