复方蛇龙胶囊对链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠肾组织PI3K_Akt_mTOR信号通路及PTEN的影响.pdf
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1、基础研究中国民间疗法 C H I N A SN A T U R O P A T H Y,J u l.2 0 2 3,V o l.3 1N o.1 4 基金项目:山西省应用基础研究计划(2 0 1 9 0 1 D 2 1 1 5 2 6)作者:平高华,E-m a i l:l f f 1 7 1 2 9 0 6 4 2 2 6 2 0 2 21 6 3.c o m复方蛇龙胶囊对链脲佐菌素诱导的糖尿病肾病大鼠肾组织P I 3 K A k t m T O R信号通路及P T E N的影响平高华(山西省中医院,山西 太原0 3 0 0 1 2)【摘要】目的:探讨复方蛇龙胶囊对链脲佐菌素(S T Z)诱导
2、的糖尿病肾病(D N)大鼠肾组织磷脂酰肌醇3-激酶(P I 3 K)/蛋白激酶(A k t)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTO R)信号通路及第1 0号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(P T E N)的影响。方法:从4 0只雄性S P F级健康W i s t a r大鼠中随机选取8只作为对照组,其余大鼠建立D N模型,将3 0只建模成功大鼠随机分为模型组、氯沙坦组和复方蛇龙胶囊组,每组1 0只。氯沙坦组给予氯沙坦1 0m g/k g灌胃,复方蛇龙胶囊组给予复方蛇龙胶囊3.5 6g/k g灌胃,对照组与模型组均给予等量的0.9%氯化钠溶液灌胃。连续给药6周后,检测4组大鼠尿素氮(B UN)水
3、平,观察肾脏组织中P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白及mR NA表达情况。结果:与对照组比较,模型组、氯沙坦组及复方蛇龙胶囊组B UN水平均升高(P0.0 5),P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量及P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N mR NA表达量均上升(P0.0 5)。与模型组比较,氯沙坦组、复方蛇龙胶囊组B UN水平均降低(P0.0 5),P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量及P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N mR NA表达量
4、均降低(P0.0 5)。与氯沙坦组比较,复方蛇龙胶囊组B UN水平降低(P0.0 5),P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量及P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N mR NA表达量均降低(P3.0时,D N大鼠模型成功5。建模过程中两只大鼠造模失败,其余造模成功大鼠随机分为模型组、氯 沙 坦 组 及 复 方 蛇 龙 胶 囊 组,每 组1 0只。(2)药物处理 各组实验用药经0.9%氯化钠溶液配置成混悬液,充分摇匀后灌胃。对照组与模型组给予等量的0.9%氯化钠溶液灌胃,氯沙坦组给予氯沙坦1 0m g/k g灌胃,复方蛇龙胶囊组给予3.
5、5 6g/k g复方蛇龙胶囊灌胃,每天1次,连续给药6周。给药剂量根据人与大鼠的体表面积公式进行换算6。(3)大鼠B UN测定 给药结束后,所有大鼠均一次性给予2%戊巴比妥钠4 0m g/k g腹腔注射,1 0m i n后观察大鼠进行麻醉状态后采集眼眶静脉血0.5m L,按35 0 0r/m i n(离心半径1 0c m)离心1 0m i n后取上清液,采用全自动生化分析仪,根据酶联免疫试剂盒说明书检测大鼠B UN水平。(4)大鼠肾脏P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量 血液采集完毕后迅速处死所有大鼠,取出肾脏,置于液氮中冷冻保存。取1 0 0m g冷冻保存
6、的肾脏组织,研磨成匀浆,对肾脏组织细胞进行裂解处理,测定总蛋白含量,电泳分离目的蛋白质,转膜,封闭,分别加入P I 3 K、p-A k t、m T O R、p-P T E N及内参兔抗大鼠一抗、山羊抗兔二抗,孵育后显影、定影,得到结果。目的蛋白表达量=目的蛋白的吸光度值/G A P D H的吸光度值7。(5)大鼠肾脏P I 3 K、p-A k t、m T O R、p-P T E Nm R N A表达量 取1 0 0m g冷冻保存的肾脏组织,根据T R I z o l试剂盒说明书提取大鼠肾脏总R NA,并进行总R NA浓度检测,以总R NA为模板,进行逆转录实验,最终得到c R NA。根据QT
7、R-P C R试剂盒,配置2 0L的反应体系,其中包括c D NA2L,上、下游引物各1L,S Y B R2L,加入纯水补足至2 0L。扩增条件:9 5预变性3 0s,9 5变性1 0s,6 2退火3 4s,7 2延伸3 0s,4 0次 循 环。以GA P DH为 内 参,引 物 序 列 见表1。表1 糖尿病肾病大鼠肾脏各基因P C R引物序列基因引物序列P I 3 KF o r w a r d:5 -GAA C AGAT AG G C AA C G GA-3 R e v e r s e:5 -C G T C A GA C C AAGAAG C TA-3 A k tF o r w a r d:
8、5 -TA C G G C T GAT C C TAA C AT G G-3 R e v e r s e:5 -AT G T A C G C T C T A C G G T G T C A-3 mTORF o r w a r d:5 -C T C GAT G T C C A C T C G C C TA C-3 R e v e r s e:5 -A C C TA C C G C AA C GAT G C T T-3 P T E NF o r w a r d:5 -A C AT A C G G C GA C AA C AG GA C-3 R e v e r s e:5 -T G C AT C A
9、AT G T C G C T TA T C C C-3 GA P DHF o r w a r d:5 -C AG C AG T GA C AT G C A C T GA-3 R e v e r s e:5 -G C T G G C AA C T AT TAA G GAG-3 1.4 统计学方法 采用S P S S2 2.0统计软件分析数据。符合正态分布的计量资料以均数标准差(xs)表示,多组均数比较采用单因素方差分析,两两比较采用L S D-t检验。P0.0 5为差异有统计学意义。2 结果2.1 B UN水平比较 与对照组比较,模型组、氯沙坦组及复方蛇龙胶囊组B UN水平均升高(P0.0 5)
10、。与模型组比较,氯沙坦组、复方蛇龙胶囊组B UN水平均降低(P0.0 5)。与氯沙坦组比较,复方蛇龙胶囊组B UN水平较低(P0.0 5)。见表1。表1 4组糖尿病肾病大鼠尿素氮水平比较(xs,m g/d L)组别例数尿素氮水平对照组86.8 71.2 8模型组1 01 9.6 85.8 2氯沙坦组1 09.3 52.3 3复方蛇龙胶囊组1 07.4 22.1 7*注:与对照 组比 较,P0.0 5;与模 型 组比 较,P0.0 5;与 氯 沙 坦 组 比较,*P0.0 5。77中国民间疗法2 0 2 3年7月第3 1卷第1 4期 基础研究中国民间疗法 C H I N A SN A T U R
11、 O P A T H Y,J u l.2 0 2 3,V o l.3 1N o.1 4 2.2 P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N蛋白表达量比较与对照组比较,模型组、氯沙坦组及复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N蛋白表达量均上升(P0.0 5)。与模型组比较,氯沙坦组、复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N蛋白表达量均降低(P0.0 5)。与氯沙坦组比较,复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N蛋白表达量均降低(P0.0 5)。见表2。表2 4组糖尿病肾
12、病大鼠肾脏4种蛋白表达量比较(xs)组别例数P I 3 Kp-A k tmT ORp-P T E N对照组81.0 30.2 10.8 80.2 70.7 40.1 30.5 10.1 2模型组1 01.7 80.2 51.5 60.3 51.1 20.2 21.1 60.2 6氯沙坦组1 01.4 20.1 81.2 70.3 10.9 80.1 20.9 20.1 8复方蛇龙胶囊组1 01.2 10.1 5*1.1 40.2 6*0.8 50.1 5*0.7 40.1 5*注:1.与对照组比较,P0.0 5;与模型组比较,P0.0 5;与氯沙坦组比较,*P0.0 5。2.P I 3 K,磷
13、脂酰肌醇3-激酶;p-A k t,诱导磷酸化蛋白激酶;mTOR,雷帕霉素靶蛋白。2.3 P I 3 K、p-A k t、mTO R、p-P T E N mR NA表达量比较 与对照组比较,模型组、氯沙坦组及复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N mR NA表达量均上升(P0.0 5)。与模型组比较,氯沙坦组、复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N mR NA表达量均降低(P0.0 5)。与氯沙坦组比较,复方蛇龙胶囊组P I 3 K、p-A k t、mTO R及p-P T E N mR NA表达量均降低(P0.0 5)。
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