7、DNA拷贝数变化.docx

1、分子机制研究套路（七）拷贝数变异课题： A基因拷贝数变异与B疾病发生的相关性研究1概念介绍：近来的研究表明在人类与其他哺乳类动物基因组序列中DNA拷贝数变异(Copy number variation, CNV)在生物的进化、发育及疾病的发生、发展过程中均具有重要作用。所谓拷贝数变异是指与基因组参考序列相比，基因组中1 kb的DNA片段插入、缺失和/或重复，及其互相组合衍生出的复杂变异，主要表现为亚微观(Submicroscopic)片段的缺失和重复。CNV是基因组结构变异(Structural variation)的重要组成部分。CNV位点的突变率远高于单核苷酸多态性(Single nucl

2、eotide polymorphism, SNP)，是人类疾病的重要致病因素之一。CNV的形成机制有多种，可分为DNA结构重排和DNA错误复制两大类。CNV可以导致呈孟德尔遗传的单基因病与罕见疾病，同时也与复杂疾病相关，包括癌症。其致病的可能机制有基因剂量效应、基因断裂、基因融合和位置效应等。例如，拷贝数变异可以通过破坏蛋白编码基因的活性部分、改变某个基因的表达“量”或者破坏基因活性的调控区域，从而影响基因的活性。越来越多的证据显示基因组DNA拷贝数变异是肿瘤相关基因活性改变的一个重要的调控因素。值得注意的是，“拷贝数变异(Copy number variation ,CNV)”这一术语主要是

3、指遗传性的/胚系(Inherited/germline)拷贝数变化，与之对应的另一术语“拷贝数畸变(Copy number alteration ,CNA)”主要是指体细胞(Somatic)拷贝数变化，例如在癌症发生过程中新出现的DNA片段拷贝数变化。2研究思路：2.1研究对象的采集22.2 A基因全部25个外显子区域CNV的变化22.3 A基因14号外显子杂合性缺失的验证22.4 A基因14号外显子杂合性缺失的组织特异性22.5 A基因14号外显子杂合性缺失对蛋白表达的影响22.1研究对象的采集本研究共纳入例B疾病患者和例健康者。两组研究对象的性别、年龄、受教育程度等情况无明显差异。2.2

4、A基因全部25个外显子区域CNV的变化对基因25个外显子区域CNV的检测显示，第14外显子病例组有一杂合性缺失，在DGV数据库中未发现此微缺失的报道。第21和25外显子病例和对照组均有拷贝数增加，两组无明显差异。其余外显子未检测到拷贝数变异。我们抽取了个样本，用Real-time PCR进行了第14号外显子和第21号外显子拷贝数检测。结果显示，除21号外显子有一个标本两者的检测结果不一致外，其余检测检测结果一致。2.3 A基因14号外显子杂合性缺失的验证采用PCR后测序的方法，对14号外显子有杂合性缺失的样本进行了验证，结果显示这一标本在14号外显子处有一约400bp的杂合性缺失；采用PCR的

5、方法，对例健康者DNA进行了 14号外显子的杂合性缺失的检测，未发现缺失。2.4 A基因14号外显子杂合性缺失的组织特异性对脊髓、肝、心、肺、肾、皮肤组织采用PCR的方法检测了14号外显子的CNV情况，结果显示脊髓、肝、心、肺、肾、皮肤组织均具有相同的14号外显子的缺失。2.5 A基因14号外显子杂合性缺失对蛋白表达的影响Western-blot的结果显示，14号外显子的缺失破坏影响了100kDa的异构体蛋白的表达，而对150、180kDa异构体蛋白表达的影响不明显。心和肾组织的表达无明显差别。三级结构的预测显示100kDa亚型发生缺失后，产生一种完全不同的蛋白，而150、180kDa亚型发生

6、14号外显子编码的氨基酸缺失后，13号外显子和后面15号外显子编码的氨基酸连接，能形成一个和缺失前三级结构类似的结构，原来的电荷、酸碱度都未发生明显改变，加之是杂和性缺失，可能导致从Western blotting结果上看不出非常明显的改变。3应用案例：1.Gao Y, Chen X, Shangguan S, Bao Y, Lu X, Zou J, Guo J, Dai Y, Zhang T: Association study of A gene polymorphisms with neural tube defects in a Chinese Han population. Reproductive sciences (Thousand Oaks, Calif) 2012, 19(7):764-771.