基于核酸和蛋白质生物分子阵...的构建及检测应用的研究进展_倪伟伟.pdf
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1、2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023,4(1):185-203基于核酸和蛋白质生物分子阵列传感器的构建及检测应用的研究进展倪伟伟,周玲佳,王浩,李飞,韩进松(中国药科大学工学院食品质量与安全系,天然药物活性组分与药效国家重点实验室,国家中药材加工研发专业中心,江苏 南京 211109)摘要:阵列传感器是组合多个传感元件,通过交叉反应机理来区分一类目标分析物的策略,不同于传统探针类传感器“锁-钥”结合模式,阵列传感器为非特异性结合,可实现一对多的识别。然而,传感元件的制备仍然存在设计困难、合成复杂、信号转换效率低等诸多挑战。核酸和蛋白
2、具有优良的生物相容性、灵活的可编程性、易实现的功能化和优越的分子识别性质等优点。目前已经通过合理设计和可控化制备手段构建了多种基于核酸和蛋白类传感元件的阵列传感器,结合机器学习算法对所得数据进行处理,使数据可视化,构建待测物“指纹图谱”,对待测物进行区分。在此综述中,重点介绍了基于核酸和蛋白类传感元件构建的阵列传感器的多目标检测应用,并讨论了其合理的应用前景以及挑战。关键词:阵列传感器;核酸;蛋白;功能材料;传感元件中图分类号:Q816 文献标志码:AResearch progress in the construction of nucleic acid and protein biomol
3、ecular sensor arrays and their applications for rapid detectionNI Weiwei,ZHOU Lingjia,WANG Hao,LI Fei,HAN Jinsong(State Key Laboratory of Natural Medicines and National R&D Center for Chinese Herbal Medicine Processing,Department of Food Quality and Safety,College of Engineering,China Pharmaceutical
4、 University,Nanjing 211109,Jiangsu,China)Abstract:The advent of sensor arrays is inspired by the superior performance of biological olfactory and taste systems on detection,recognition,tracking,and localization.By simulating the sensing mechanism of cross-response with the olfactory and taste system
5、s,a sensor array can be constructed.Meanwhile,a series of algorithms are used to detect and distinguish targets based on fingerprints generated by the analyte to the array.However,the fabrication of sensing elements still faces many challenges,such as difficult design,complicated synthesis,and low s
6、ignal collecting efficiency.Nucleic acids and proteins have advantages in biocompatibility,flexible programmability,easy 收稿日期:2022-06-25 修回日期:2022-08-26基金项目:国家自然科学基金(82072017)引用本文:倪伟伟,周玲佳,王浩,李飞,韩进松.基于核酸和蛋白质生物分子阵列传感器的构建及检测应用的研究进展 J.合成生物学,2023,4(1):185-203Citation:NI Weiwei,ZHOU Lingjia,WANG Hao,LI Fe
7、i,HAN Jinsong.Research progress in the construction of nucleic acid and protein biomolecular sensor arrays and their applications for rapid detection J.Synthetic Biology Journal,2023,4(1):185-203DOI:10.12211/2096-8280.2022-035特约评述合成生物学 第 4 卷functionalization,and superior molecular recognition proper
8、ties.At present,a variety of sensor arrays based on nucleic acid and protein sensing elements have been constructed through rational design and controllable preparation methods.In this review,the multi-target detection applications of these sensor arrays are highlighted,and their application prospec
9、ts and challenges are addressed.Keywords:sensor array;nucleic acid;protein;functional material;sensing element阵列传感器是受哺乳动物的嗅、味觉系统的启发而发展起来的一种高效的识别手段。它由多种传感元件组成,通过这些传感元件的协同作用产生“指纹图谱”实现对分析物的识别和检测1-2。阵列传感器能够较好区分结构或化学性质类似的物质,在识别和区分复杂的样品方面具有独特的优势3。阵列传感器目前主要由多种有机小分子、聚合物和纳米材料构建。然而,可供选择的传感元件的数量有限,探索新的荧光团进度缓慢、
10、合成较为复杂且信号转换效率低,都阻碍了它们的实际应用4-7。相较于传统的传感元件,基于核酸和蛋白等生物大分子的传感元件具有许多优异的特性,包括良好的生物相容性、灵活的可编程性且易于功能化,因此,核酸和蛋白是一类构建高效、强大传感元件的理想材料。目前已有多种基于核酸和蛋白的阵列传感器8-10。以核酸为传感元件的传感器具有以下优点:通过四个核苷酸碱基和不同186第 4 卷 长度的核酸可组合出无限的序列,不存在多样性的问题。核酸具有高度环境敏感性,受金属离子、蛋白质、小分子、pH值和光等外界因素的影响,核酸可发生构象转变,诱导了核酸多样化的响应行为。目前核酸序列可通过标准流程进行合成修饰,可进一步功
11、能化11-12。基于蛋白类传感元件构建的阵列传感器,一方面可作为识别元件,通过仿生技术来实现对待测物的定性和定量区分,如嗅觉气味结合蛋白、味觉气味结合蛋白等;另一方面,荧光蛋白这一类特殊蛋白常用作荧光团引入到阵列传感器中,通过对其修饰可以得到不同激发、发射波长的荧光蛋白,光学性质易于调控。本综述总结了近十年来基于核酸和蛋白阵列传感器的最新研究进展(图1),主要介绍了阵列传感器的构建策略以及在识别不同目标方面的应用,提出了基于核酸和蛋白的阵列传感器面临的一些挑战和前景。1 基于核酸元件构建阵列传感芯片及分子识别策略概述基于核酸的阵列传感器构建策略主要有两种。第一种是通过SELEX合成一系列的短单
12、链DNA或RNA序列,其具有非常高的亲和力和特异性,能够通过构象变化与小分子、蛋白质、细胞和细菌等相互作用13。因此,这类适配体被广泛用于设计基于“锁-钥”结合模式的传感器14。许多细胞-SELEX适配体对一个特定的细胞系的识别是半特异性的,基于适配体对其靶细胞和非靶细胞的不同亲和力,Tan等15使用适配体修饰的磁性纳米粒子来区分不同的细胞类型。Wang等16构建了一种多色细胞成像法,使用荧光标记的适配体来区分癌细胞的类型。第二种是通过核酸和待测物相互作用得到各种信号,如荧光、吸光度、反射率、电化学信号等。用染料来标记核酸是目前使用 最 为 广 泛 的 方 法17。同 时,金 纳 米 粒 子(
13、AuNPs)和二维纳米材料的出现极大促进了阵列传感器信号转导的发展。在信号处理方面,目前常用的统计方法主要有主成分分析(PCA)、线性判别分析(LDA)和层次聚类分析(HCA)等18。以核酸作为元件构建阵列传感器,主要是通过将核酸与市售荧光染料、镧系金属离子、金属有机框架、二维金属纳米片、金属氧化物纳米颗粒、有机大分子、有机小分子等复合,选取同体系中贡献较高的多个元件,构建传感器阵列,并主要通过荧光、比色、电信号等输出结果,再通过机器学习算法对数据进行处理,实现数据可视化。本章节还简要介绍通过复合有机大分子放大化学荧光信号的方法。在这里,我们综述了近几年来基于核酸传感元件的阵列传感器的构建以及
14、在疾病、环境等方面的应用。1.1 核酸单独作为元件构建阵列传感器由于不同类型的细胞表面差异性小,实现早期准确识别肿瘤细胞仍然是一个挑战。作为一种图图1使用核酸和蛋白作为传感元件构建传感器阵列的时间线Fig.1Timeline for developing sensor arrays using nucleic acids and proteins as sensing elements187合成生物学 第 4 卷替代方法,阵列传感器为癌症的早期诊断提供一个机遇。核酸和癌细胞之间的相互作用与核酸的序列以及标记核酸的荧光团有关。Wang等16使用了异硫氰酸荧光素酯(FITC)、花菁染料3(Cy3)
15、和花菁染料5(Cy5)标记的核酸来构建阵列传感器并将其用于细胞的检测。荧光素和花菁染料的结构差异使其可以与细胞产生不同的相互作用,同时使用LDA算法对其进行分类,成功从大量的正常细胞中检测出癌细胞,并且可以区分特定细胞的类型(Hela、MCF7、HepG2和 A549)。蛋白酶能够调节蛋白质的功能,并作为某些疾病的生物标志物用于早期诊断。Okada等19通过一组荧光团标记的单链DNA(ssDNA)检测各种蛋白酶。这类阵列传感器采用单独核酸作为元件,构建较为简单,但对待测样品区分能力一般。1.2 核酸与其他物质复合构建阵列传感器许多 DNA 序列具有显著的金属离子结合力20。DNA链的磷酸基团和
16、碱基可以通过静电作用和配位效应与金属离子相互作用。不同的金属离子表现出不同的结合方式和亲和力。1.2.1 核酸-金属离子复合体系细胞内的硫醇在疾病诊断中扮演着至关重要的作用,它们之间的结构相似,因此对它们进行有效区分非常困难。为了解决这个问题,Qiu等21基于 DNA-染料-金属离子复合体系构建了一个快速灵敏的阵列传感器来区分硫醇,主要通过银离子(Ag+)和铜离子(Cu2+)与DNA-染料复合物相互作用,进而改变DNA-染料的荧光强度。硫醇可以从 DNA-染料-离子复合体系中竞争结合金属离子,导致DNA-染料复合物的荧光强度恢复,不同金属离子复合体系产生多种响应模式,生成的指纹图谱可用来区分不
17、同的硫醇。除常见有机荧光团外,一些镧系发光金属也是构建荧光阵列传感器的理想材料。富含鸟嘌呤/胸腺嘧啶的DNA可以与铽离子(Tb3+)配位并使其发光。基于这种特性,DNA与Tb3+的复合物可用于金属离子的检测22。Xue等23报道了富含胞嘧啶和胸腺嘧啶的ssDNA可以使铕(Eu3+)发出荧光。其他金属离子与 ssDNA 结合,显著地将ssDNA的天线效应向Eu偏移。因此,Eu-C16和Eu-T16可以用于构建传感阵列实现不同的金属离子的检测。在这类阵列传感器中,镧系离子通过非共价相互作用与核酸复合组建阵列传感器,构建简单且对待测物灵敏,但识别范围较窄。1.2.2 核酸-金属有机框架复合体系含有三
18、种不同金属(Cu、Fe、Zr)离子的纳米级金属有机框架(NMOFs)可以通过-相互作用吸附荧光团标记的 ssDNA,并通过能量转移导致荧光团标记的 ssDNA 猝灭荧光24图 2(a)。二者形成的复合物与不同的蛋白质和细胞产生不同程度的相互作用,导致荧光团标记的ssDNA释放并且使荧光恢复,实现了对蛋白质和细胞的并行检测。核酸-金属有机框架复合体系结构新颖,识别灵敏,但结构体系较为复杂,合成难度较大。1.2.3 核酸-二维金属纳米片复合体系纳米材料,如AuNPs、氧化石墨烯(GO)及二氧化锰(MnO2)纳米片等,具有可调节的形态、尺寸和独特的催化活性,被广泛用作传感元件。这些二维纳米材料对荧光
19、团具有强的荧光猝灭能力,可用于构建纳米复合体系,实现信号放大的灵敏检测。具有类石墨烯特征的MoS2和WS2纳米片对荧光标记的ssDNA 具有较好的亲和力和荧光猝灭能力。Yigit等25-27使用nGO、MoS2 和 WS2纳米片和多个荧光团标记的DNA构建了一个通用型阵列传感器 图 2(b),实现了对蛋白质、癌细胞、miRNA和不同结构状态的大分子的鉴定。该小组还使用5个荧光标记的ssDNA作为阵列传感器的传感元件,区分了具有单核苷酸差异的let-7 miRNA家族的9个成员28。Qi等29使用GO、MoS2纳米片和一个DNA 库来构建阵列传感器,并将其用于细菌和蛋白质的检测。综上,基于核酸-
20、二维金属纳米片的阵列传感器可为识别范围和识别精度的提高提供简单而有价值的策略。1.2.4 核酸-金属氧化物纳米颗粒复合体系除了二维纳米片(GO、MoS2 和 WS2)外,金属 氧 化 物 纳 米 颗 粒(MONPs)对 荧 光 标 记 的ssDNA 也有强亲和力和荧光猝灭效应。Liu 等30探究了在目标阴离子存在下MONP吸附DNA,引起荧光猝灭,继而释放DNA,荧光恢复。Ramn188第 4 卷 等31以纳米多孔阳极氧化铝(NAA)支架装载荧光指示剂罗丹明B,在孔入口用DNA适体进行覆盖,将其用于金黄色葡萄球菌的检测,此外,将3个MONP-DNA 复合物用于构建阵列传感器实现了磷酸根、砷酸根
21、和亚砷酸根等常见阴离子的检测。核酸-金属氧化物纳米颗粒复合体系可用于蛋白模式识别,在组织病理学中得到广泛运用,表现出极大的癌症诊断潜力。1.2.5 核酸-金纳米粒子复合体系AuNPs 的颜色很大程度上取决于其聚集程度,DNA 可以共价连接或非共价吸附到 AuNPs 的表面,以稳定 AuNPs 不发生聚集。Lu 等32通过AuNPs和碱基之间的非共价相互作用开发了一种阵列传感器。针对畜牧业抗生素残留问题,Wei等33使用含有两条不同长度的 ssDNA 的 AuNPs 作为阵列构建了一种阵列传感器。Yan等34使用ssDNA-AuNPs复合物构建阵列传感器来识别牛奶中的抗生素。Wang 等35使用
22、两条 DNA 来修饰AuNPs,通过调整两条DNA的摩尔比构建了用于蛋白质测定的阵列传感器。Jia等36通过将非特异性寡核苷酸以 AuS 键方式修饰于 AuNPs 表面,构建了一种用于区分蛋白质的阵列传感器。阳离子聚合物也可以与AuNPs相互作用并导致AuNPs聚集。基于这一现象,Xi等37将3个非特异性DNA链与不同的蛋白质混合,随后加入阳离子聚-(二烯丙基二甲基氯化铵)(PDDA)和AuNPs,DNA和不同蛋白质之间的差异化相互作用导致剩余DNA链的数量不同,通过静电相互作用与PDDA形成复合物。多余的PDDA可以进一步诱导AuNPs的聚集,使AuNPs的颜色变化,进而区分不同的蛋白质图3
23、(a)。Yang等38使用 DNA 修饰的催化 AuNPs开发了一种用于蛋白质识别的阵列传感器。用DNA修饰的AuNPs和纯AuNPs作传感元件,将它们与蛋白质样品一起孵育后,加入HAuCl4和NH2OH以使颗粒在AuNPs表面生长。由于DNA、AuNPs 和蛋白质之间的相互作用对颗粒生长有显著影响,因此产生了具有不同形态和颜色的纳米颗粒图3(b)。利用这一现象,Yang等39构建了用于区分细胞类型的阵列传感器。Li 等40利用蛋白质诱导的DNA-AuNPs-GO的颜色变化构建了一种阵列传感器来区分不同亚型和等级的肿瘤细胞。Sun等41将锆金属-有机框架(Zr-MOFs)与固定有 ssDNA的
24、AuNPs复合以识别蛋白质和人类精液样本。AuNPs 在各种反应中具有催化活性。Wei等42基于蛋白质和DNA之间的相互作用扰乱了底物对AuNPs表面的影响,构建了一个用于蛋白质识别的阵列传感器。基于此,Yang 等43基于图图2(a)基于含有不同金属离子和荧光团标记ssDNA的NMOF的传感器阵列方案24经许可后改编,版权所有(2019)美国化学学会;(b)使用二维纳米颗粒(WS2、MoS2和nGO)和荧光团标记的 ssDNA的miRNA类似物识别方案26经许可后改编,版权所有(2018)美国化学学会Fig.2Diagrams for sensor arrays based on NMOFs
25、 containing different metal ions and fluorophore-labeled ssDNAs(a)24,and miRNA analogues discrimination using two-dimensional nanoparticles(WS2,MoS2,and nGO)and fluorophore-labeled ssDNAs(b)26,which were adapted with permission.189合成生物学 第 4 卷AuNPs在H2O2存在下可催化3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)产生蓝色,使用 3 种 DNA 修饰的AuNP
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