二甲双胍通过FGFR4_M...瘩成纤维细胞的上皮间质转化_张永红.pdf
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1、东南大学学报(医学版)(),;():收稿日期 修回日期 基金项目 河南省医学科技攻关计划(联合共建)项目()作者简介 张永红(),女,河南漯河人,主治医师,医学硕士。:引文格式 张永红,李存涛,高明敏,等 二甲双胍通过 信号通路抑制皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的上皮间质转化 东南大学学报(医学版),():论著 二甲双胍通过 信号通路抑制皮肤瘢痕疙瘩成纤维细胞的上皮间质转化张永红,李存涛,高明敏,张玉红(郑州大学附属郑州中心医院 皮肤科,河南 郑州)摘要 目的:探讨二甲双胍()抑制低氧诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞()上皮间质转化()的作用机制。方法:被分为低氧组和对照组,低氧组细胞在低氧环境下培养 以诱导
2、,对照组细胞常规培养。用 或其溶剂生理盐水(生理盐水组)低氧诱导;在 和低氧条件下用纤维母细胞生长因子受体()过表达载体()或空载体()处理,或者在 和低氧条件下用重组人巨噬细胞刺激 蛋白()处理;低氧条件下的 分为生理盐水组、组、组、组、组。采用细胞计数试剂盒()评估细胞增殖活力,迁移小室实验测量细胞迁移,蛋白免疫印迹法评估、钙黏蛋白、波形蛋白和 的表达水平。结果:低氧组 的细胞增殖活力、迁移率及 较对照组明显增加。组的、表达以及低氧诱导的细胞增殖活力、迁移率及 标志物的表达量都较生理盐水组明显降低()。与 组及 组比较,组中、表达以及低氧诱导的细胞增殖活力、迁移率和 标志物均明显增高()。
3、与 组相比,组 表达及低氧诱导的细胞增殖活力、迁移率、标志物的 表达量均明显增高(.)。结论:通过抑制 信号通路来消除 中低氧诱导的。关键词 二甲双胍;上皮间质转化;纤维母细胞生长因子受体;巨噬细胞刺激;瘢痕疙瘩中图分类号 文献标志码 文章编号():,(,):()()():,()()(),(),(),:,(),(),():;瘢痕疙瘩是一种引起人体不适、机体功能受限以及心理障碍的皮肤疾病,瘢痕疙瘩内部常表现出缺血低氧特征。目前已证明上皮间质转化(,)是参与瘢痕疙瘩形成和发展的关键细胞学改变。二甲双胍(,)是一种可以抑制肿瘤和糖尿病中 的关键药物;在体外也可抑制瘢痕疙瘩形成。然而 诱导抑制瘢痕疙瘩
4、的完整机制仍然未知,因此本研究观察 对瘢痕疙瘩成纤维细胞(,)的作用并探讨其机制。材料与方法 临床样本瘢痕疙瘩标本及邻近正常皮肤组织采集于我院皮肤科。例瘢痕疙瘩患者均为黄种女性,年龄分别为、岁,瘢痕疙瘩位置均在耳垂。本研究中执行的所有程序均经我院医学伦理委员会批准,所有受试者均签署知情同意书。的方法:在低氧培养箱中培养 以诱导,分为对照组和低氧组。用 或其溶剂生理盐水(生理盐水组)低氧诱导:在 和低氧条件下用纤维母细胞生长因子受体(,)过 表 达 载 体(,)或空载体(,)处理 或者在 和低氧条件下用重组人(,)巨噬细胞刺激(,)蛋白()处理。试剂与耗材()购于美国 公司。杜氏改良培养基()和
5、胎牛血清()购于美国 公司。购于美国派普泰克公司。和空载体(,)购于上海 公司。试剂购于美国 公司。细胞计数试剂盒()、反应混合物逆转录 试剂盒、试剂盒、试剂盒购于上海碧云天公司。蛋白酶抑制剂的 缓冲液、聚偏二氟乙烯膜购于美国 公司。抗人、钙黏蛋白、抗人波形蛋白、抗人 一抗购于美国 公司。细胞培养原代人 根据文献报道进行分离。手术切除人瘢痕疙瘩组织的表皮和脂肪组织,只保留纤维组织的真皮层,随后切成小块。组织小块在包含 倍胶原酶裂解缓冲液的 中消化,下 离心 后,收集沉淀物并在补充有 的青霉素 链霉素和 胎牛血清的(、)中培养。细胞活力检测 实验用于测量细胞活力。将(每孔 个)接种到 孔板中。分
6、别在常氧下(设为对照组)和低氧培养箱(、)中东南大学学报(医学版)年 月,()培养,低氧培养箱中细胞再分为生理盐水组和 组两组。对照组细胞培养 ,低氧培养的两组分别加生理盐水 或 处理细胞 后,每孔加入 ,孵育 。使用酶标仪在 处测量 组的吸光度值。低氧培养条件下 细胞的处理与分组根据制造商提供的说明,使用 试剂将 的 或 的 转入 细胞。将转染的细胞培养 ,并收集用于实时定量(,)和蛋白免疫印迹分析。根据是否使用 治疗、联合使用 过表达,或联合使用 处理,将 在低氧条件下进行实验观察。在低氧条件下培养 ,分为 组、生理盐水组、联合 过表达载体转染()组、联合空载体()()组、联合、组。在 下
7、以 的浓度储存。低氧培养环境下,组用 处理细胞;生理盐水组用等体积的生理盐水处理细胞;组在转染 的同时用 处理细胞 ;组 在 转 染 的 同 时 用 处理细胞 ,组用 和 处理细胞 。用 试剂盒提取 组和 组 的总。根据制造商提供的说明,使用 反应混合物逆转录。随后的定量 在 系统中使用 试剂进行。具体引物如下:正向 ,反 向;:正向,反向;钙黏蛋白:正向,反向;波形蛋白:正向,反 向;肌动蛋白:正向,反向。根据制造商的协议,在总体积 的反应混合物中进行,并按以下步骤进行扩增:,然后 和 循环 次。生物学重复为。方法用于计算,其中 目标基因 肌动蛋白,测定值 校正值。蛋白免疫印迹实验离心收集
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