发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立_赵兴坤.pdf
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1、第 卷第期 草地学报 年 月 :发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立赵兴坤,孙昊,杨丽云,罗丽娟,刘攀道(海南大学热带作物学院,海南 海口 ;中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室,海南 海口 )摘要:细茎柱花草()是圭亚那柱花草(.)的野生近缘种,具有茎秆直立、种子落粒性低、抗旱能力较强等特点。为开发一种高效的细茎柱花草毛状根转化体系,本研究以细茎柱花草子叶节为外植体及个发根农杆菌为供试菌种,探索菌液浓度、侵染时间、共培养时间对毛状根转化效率的影响。结果表明 为诱导毛状根发生的最优菌株,诱导率为 。其中,该菌株诱导毛状根产生的最佳条件为
2、菌液浓度 、侵染时间为 、共培养,转化效率达 。同时,获得的转基因材料通过聚合酶链式反应()和蛋白质免疫印迹()分子鉴定方式,证实了外源基因已整合到细茎柱花草毛状根的基因组中。因此,本研究成功建立了一种细茎柱花草的毛状根转基因体系。关键词:细茎柱花草;子叶节;发根农杆菌;转基因;毛状根中图分类号:文献标识码:文章编号:(),(,;,):.,.,.,.(),.:.;收稿日期:;修回日期:基金项目:海南省重点研发计划科技合作方向项目();海南省科协青年科技英才学术创新计划项目();海南省自然科学基金高层次人才项目();中国科协青年人才托举工程第五届项目()资助作者简介:赵兴坤(),男,汉族,硕士研
3、究生,主要从事热带牧草转基因技术研究,:;通信作者 ,:;柱花草属()植物属于豆科蝶形花亚科,全属约有 个种,遗传多样性丰富,分布于美洲、非洲和东南亚,其起源中心为巴西和墨西哥。圭亚那柱花草(.)是目前世界范围内栽培面积最大的柱花草属植物,在热带与亚热带地区,既可作为物草种植,也可作为绿肥作物种草地学报第 卷植,用于提升土壤肥力和防止水土流失。圭亚那柱花草最早由中国热带农业科学院于 世纪八十年代引入我国,主要用作幼龄橡胶园的覆盖作物。随后,中国热带农业科学院又陆续从国际热带农业中心()引进了圭亚那柱花草种质 余份,并利用这些种质为亲本培育了 个圭亚那柱花草的国家审定牧草品种,这些品种在海南、云
4、南、贵州、广西、广东等省区已累计推广 多万公顷,圭亚那柱花草已成为我国最重要的热带豆科牧草之一。圭亚那柱花草相较于其他柱花草属植物具有产量高、粗蛋白含量高、饲用品质好、对酸性土壤逆境胁迫(低磷、铝毒害、锰毒害)的适应性好等优点,也存在茎秆匍匐、抗寒性低、落粒性强缺点,因此,利用与近缘种杂交的方式对圭亚那柱花草进行改良是今后柱花草育种的主要目标。细茎柱花草(.)在植物分类学上原被归为圭亚那柱花草的变种(.),后来被认定为一个新种。细茎柱花草与圭亚那柱花草在基因组分型上均为 型二倍体种,在目前发现的柱花草属植物中两者亲缘关系最近,可种间杂交(无生殖隔离)。作为圭亚那柱花草的野生近缘种,细茎柱花草因
5、产量低、易感炭疽病、木质化程度高等缺点,未被驯化选育成牧草品种用于生产利用。但是,细茎柱花草也具有明显的优点,如抗旱能力较强、种子产量高(落粒性低)、茎秆直立利于机械化收割等特点。因此,细茎柱花草可作为改良现有柱花草品种的理想材料。发根农杆菌()是一种革兰氏阴性菌,广泛分布于土壤中,早在 世纪初科学家就发现其能诱导一部分植物产生毛状根,其携带 质粒中的 片段进入植物细胞并整合进植物基因组中,能刺激植物产生大量的毛状根,且产生的毛状根均由单个的细胞发育而来,遗传性状稳定,无嵌合体 。毛状根转基因技术已经在多种植物中被广泛应用,本文旨在利用发根农杆菌介导,建立一种适用于细茎柱花草的转基因毛状根体系
6、,为今后的柱花草属植物的基因功能研究及生物育种提供技术储备。材料与方法 试验材料 植物材料与试剂本研究使用的细茎柱花草种子材料由中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所提供。抗体、山羊抗兔 抗体均采购于美国 公司。菌株与质粒发根农杆菌 ,和大肠杆菌 均采购于上海唯地生物技术有限公司;为常见的双元载体,该载体含有绿色荧光蛋白报告基因(),由本实验室保存并提供。试验方法 菌株的选择和活化选取种发根农杆菌菌株 、进 行 试 验。将种发根农杆菌在含有 链霉素的 固体培养基上划线,培养箱中培养。挑取单菌落分别接种于含有链霉素的 液体培养基中,下 培养。取 菌液转移至 含有链霉素的 液体培养基中,培养菌液
7、 至,离心 ,弃上清,使用不含抗生素的 液体培养基重悬菌体,菌液用于侵染细茎柱花草外植体。载体质粒转入发根农杆菌采用冻融法将 质粒转入发根农杆菌 感受态。取 质粒加入 感受态中混匀,冰上静置 、液氮 、水浴 、冰浴 ,加入 无抗生素的 液体培养基,震荡培养,吸取 菌液涂布于含有 链霉素和 卡那霉素的 固体平板上 培养,挑取单克隆菌落,进行 鉴定,选择阳性克隆菌落保存,用于下一步转化柱花草。柱花草无菌苗的培育取适量的细茎柱花草种子去除外种皮,挑选完整饱满的种子放置于 离心管中,加入 去离子水,水浴 打破种子的休眠,于无菌工作台中吸取去离子水,的酒精浸泡,无菌水洗涤次,氯化汞溶液浸泡 ,无菌水洗涤
8、次,置于无菌滤纸上吸干。将灭菌后的种子使用无菌的镊子接种于培养基上进行萌发。外植体的获得及毛状根的诱导使用已灭菌的镊子将萌发的无菌苗从培养基上取出,置于铺有无菌水浸湿滤纸的无菌培养皿上,使用无菌手术刀从柱花草子叶节下约 处切去下胚轴,再沿子叶节将两片子叶切开,同时在子叶上划出个伤口,即获得侵染所需的子叶外植体。将子叶外植体放入侵染液中侵染 ,用镊子将侵染后的外植体放至无菌滤纸上吸干多余菌液,置于 固体培养基上 暗培养;暗培养结束后使用第期赵兴坤等:发根农杆菌介导的细茎柱花草毛状根转化体系的建立特美汀()液体培养基清洗外植体,最后将外植体置于特美汀固体培养基上、光照条件下培养。图细茎柱花草子叶毛
9、状根的诱导 注:,待转化细茎柱花草幼苗;,子叶外植体获取;,发根农杆菌侵染;,共培养;,毛状根诱导培养;,毛状根脱菌培养 :;不同发根农杆菌侵染实验利用 的种发根农杆菌菌液分别侵染细茎柱花草的子叶外植体,诱导培养 天后统计毛状根的诱导率。本试验共个重复,每个重复 个子叶外植体。毛状根诱导率()生根外植体数外植体总数 菌液浓度、侵染时间及共培养时间正交试验基于菌液浓度、侵染时间、共培养时间开展()正交实验,菌液浓度分别设置为 ,;侵染时间设置为 ,;共培养时间设置为,。诱导 天后对毛状根进行形态检测,使用双波长便携式荧光蛋白激发光源()观察并统计发绿色荧光的毛状根数目,计算毛状根转化率,同时对发
10、绿色荧光的毛状根进行继代培养。毛状根转化率()发绿色荧光根总数毛状根总数 转基因毛状根的 分子鉴定使用双波长便携式荧光蛋白激发光源观察 的表达情况,初步筛选出阳性毛状根。取 毛状根样品,液氮研磨,通过 法 提取 。以 为模板,通过四对基因特异引物进行 验证,其中 为发根农杆菌 质粒 插入区内的毛状根诱导基因,其上游引物为 (引物方向 ,下同),下游引物为 ,产物长度为 ;为 载体上 插入区内的绿色荧光蛋白基因,其上游引物为 ,下游引物为 ,产物长度为 ;为 载体上 插入区内的抗除草剂基因,其 上游引物为 ,下游引物为 ,产物长度为 ;()为柱花草内参基因,其上游引物为 ,下 游 引 物 为 ,
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