肺岩宁方介导Atg5对肺癌A549细胞自噬调控抗肺癌侵袭转移的实验研究.pdf
《肺岩宁方介导Atg5对肺癌A549细胞自噬调控抗肺癌侵袭转移的实验研究.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《肺岩宁方介导Atg5对肺癌A549细胞自噬调控抗肺癌侵袭转移的实验研究.pdf(9页珍藏版)》请在文库网上搜索。
1、2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 肺岩宁方介导Atg5对肺癌A549细胞自噬调控抗肺癌侵袭转移的实验研究马玥1,徐振晔1,2,王立芳1,郑展1,邓海滨1,张琦君2(1.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032;2.上海市虹口区江湾医院 上海 200081)摘要:目的探讨肺岩宁方(Feiyan Ning Decoction,FYN)通过介导 Atg5(自噬相关靶向基因 5,Autoph
2、agy-related gene 5)自噬相关基因调控人肺腺癌A549细胞自噬,及其对A549肺癌细胞增殖、迁移、侵袭等作用的影响。方法肺岩宁方干预培养肺癌A549细胞,通过运用CCK-8(Cell Counting kit-8)细胞增殖实验检测肺岩宁方对细胞增殖抑制率的影响,显微镜下观察肺岩宁方作用后的细胞形态学改变;采用划痕实验检测肺岩宁方及自噬抑制剂氯喹(Chloroquine diphosphate salt,CQ)对肺癌A549细胞迁移能力;运用Transwell细胞侵袭实验检测肺岩宁方及氯喹对肺癌A549细胞侵袭能力;运用Western Blot检测自噬相关蛋白Atg5、LC3表达
3、情况;运用透射电子显微镜观察肺癌A549细胞在肺岩宁方干预下的自噬结构形态改变情况。结果CCK8检测试验结果:肺岩宁方能有效抑制A549细胞增值活力(P 0.01),其优化浓度为200 g mL-1;划痕实验结果:与对照组比,肺岩宁方干预A549细胞迁移能力减弱(P 0.05),A549细胞在FYN联合CQ的作用下迁移能力明显减弱(P 0.01);Transwell实验结果:与对照组比较,肺岩宁方抑制细胞侵袭转移能力(P 0.05),FYN联合CQ细胞侵袭力明显抑制(P 0.05);Western Blot实验结果:肺岩宁方下调自噬相关蛋白Atg5、LC3表达能力(P 0.01);透射电子显微
4、镜观察结果:肺岩宁方抑制自噬结构的出现。结论肺岩宁方介导Atg5自噬相关基因,具有调控人肺腺癌A549细胞自噬能力,可抑制A549细胞增殖活力、迁移能力、侵袭转移水平。关键词:肺岩宁方 肺癌 肺癌A549细胞 细胞自噬 增殖 侵袭转移doi:10.11842/wst.20210122007 中图分类号:R256.1 文献标识码:A据统计世界范围内肺癌新发病例和死亡病例仍数以百万计,占各类癌病新发病例的11.06%,死亡病例占比为18.4%1。就2015年统计的我国发生4292000例新发癌症病例和2814000例癌症死亡病例,其中肺癌显而易见是最常见的癌症,也是肿瘤死亡的主要原因2。肺癌的相关
5、研究在科技和社会的快速发展中蒸蒸日上取得进展,科研人员与临床医务工作者积极与癌病赛跑,不断更新探索以寻求高效治疗方法,但肺癌的转移、转归、治疗却仍然存在着瓶颈。目前肺癌的临床治疗可行性手术切除是有效且常规的,然而往往很多患者查出肺癌就已经处于中晚期,中晚期肺癌患者生存率低,存在难以手术或极易复发转移的风险,且中晚期肺癌患者术后5年生存率低至23%3,其中转移与复发是影响生存率的主要原因4。肺癌侵袭性高、易复发转移,是目前国内外研究的难点重点,中医药抗肺癌转移具有独特优势,体现中医既病防变原则,结合多途径、多靶点,从基因层面、免疫层面等,结合不同转移部位、患者症状,发挥辨证论治特色起到 收稿日期
6、:2021-01-22 修回日期:2021-07-14 上海市教育委员会科研创新计划项目重大项目(2017-01-07-00-10-E00064):源于精气理论的肺岩宁方抗肺癌生长与转移作用机制的研究,负责人:邓海滨;虹口区卫生和计划生育委员会“国医强优”三年行动计划项目中西医结合专项(HGY-ZXYJH-2018-02):从补、从下、从疏法乳腺癌中西医结合治疗方案的临床研究,负责人:车勇。通讯作者:徐振晔,主任医师,博士生导师,上海市名中医,终身教授,主要研究方向:中医药防治恶性肿瘤。1230 Modernization of Traditional Chinese Medicine and
7、 Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化专题讨论一:基于精亏脾虚理论中医药治疗恶性肿瘤临床与机理研究抗肺癌转移疗效5。不同肿瘤中虽然广泛存在着遗传或基因突变,但他们也存在有相似的代谢,譬如自噬。自噬是自噬小体将内环境中各类细胞器等成分利用靶向溶酶体合并清除的一种自体应激降解过程6,细胞自噬是一个为了处理应激反应而快速被激活的自身降解过程7。自噬具有双重性,细胞自噬可以促进肿瘤的发展,然而当功能障碍时亦可以过犹不及,导致自身灭亡。以此为契机,打破传统抗癌药物常规弊端,调控细胞自噬也是一种治疗肺癌的可能性。自噬的发展变化在
8、细胞微环境中揭示了万物变化不外阴阳之中,自噬调控下的胞内物质能量的转化也是阴阳转化的过程,中医所谓的阴阳平和思想与自噬调控细胞内环境稳态、与中医维护机体阴平阳秘的作用不谋而合8。目前已有的实验研究证明,中药单体、中药复方具有调控肿瘤细胞自噬水平,发挥抗肿瘤作用9,从细胞自噬角度去探索中医药治疗肺癌的新思路,在临床和科研上都具有深远意义。本研究拥有基金项目支持,通过初步进行基础研究以基于细胞自噬源于精气理论的肺岩宁抗肺癌转移作用探索,而推进中医药抗肺癌的机制研究,从而进一步理论指导实践,在临床上中西医结合运用,达成治疗及研究目的。肺岩宁方具有抗肺癌复发转移的疗效,是上海市名中医徐振晔教授以益气养
9、精为根基积攒临床数十年实践经验成方,不仅在临床上取得良好的疗效,在提高患者生活质量的前提下延长患者生存时间10,同时在前期基础研究中也展现其抗肺癌侵袭转移的显著特征11。本研究意在初探肺岩宁方调控肺癌细胞自噬的机制,进一步探讨中医药在抗肺癌侵袭转移,及治疗肺癌中的新前景和新靶向。1 材料与方法 1.1材料1.1.1细胞人非小细胞肺癌A549细胞株,贴壁,采购于中国科学院上海细胞库。1.1.2药物与试剂肺岩宁方(生黄芪、七叶一枝花、白术、女贞子、黄精、灵芝、仙灵脾、山萸肉等中草药组成),中药饮片由上海龙华医院中药房提供,购自GAP认证基地,并由龙华医院药剂科进行质控。中药饮片常规水煎,水浴浓缩至
10、生药含量为 2.0 gmL-1,利用水提醇沉法制备 成冻干粉,超净台内除菌分装,封口膜封口,保存于 -20备用。上述肺岩宁方冻干粉在用于体外细胞实验时,需称重溶解后,在0.22 m滤网中过滤除菌,4保存。氯 喹:自 噬 抑 制 剂 氯 喹,Sigma 公 司,批 号:105M4035V。细胞实验中融于磷酸盐缓冲液(PBS)后在0.22 m滤网过滤除菌备用。自噬抑制剂氯喹使用剂量为20 mmol L-1。磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)、RPMI-1640 培养基(美国 Hyclone 公司);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(以色
11、列 Biological Industries公司);0.25%Trypsin-EDTA 胰蛋白酶(加拿大 Gibco公司);Pen Strep抗生素青霉素-链霉素(双抗)(美国Gibco 公司);二甲基亚砜(DMSO)(德国 Biofroxx 公司);Cell Counting Kit-8(CCK-8)(日本同仁公司);Transwell 板(美国 corning 公司);BD Matrigel 基质胶(美国 BD 公司);结晶紫(中国碧云天公司);抗体:-Actin、LC3(D11)XP(R)Rabbit mAb、Atg5(D5F5U)Rabbit mAb、Anti-Rabbit IgG(
12、美国CST公司)。1.1.3仪器MSC-Advantage 型 垂 直 流 超 净 工 作 台(美 国Thermo 公 司);MCO-18AIC 型 CO2培 养 箱(日 本SANYO公司);TDL-5C型低速台式离心机(中国安亭公司);5430R 型高速冷冻离心机(德国 Eppendorf 公司);Infinite F200 型多功能酶标仪(瑞士 TECAN 公司);DMI3000B型荧光倒置显微镜(德国Leica公司);EC3 410 化 学 发 光 成 像 系 统(美 国 UVP);Mini-PROTEAN-Tetra蛋白垂直电泳系统(美国Bio-Rad公司);H7650透射电子显微镜(
13、日本日立公司)。1.2细胞培养肺 癌 A549 细 胞 株 在 含 有 10%胎 牛 血 清 及 100 mL-1青霉素和100 mL-1链霉素的RPMI-1640完全培养基中培育,置于37、5%CO2、饱和湿度环境标准生长条件下的细胞无菌培养箱中,0.25%胰蛋白酶消化传代,取对数生长期的细胞进行后续实验。1.3检测与方法1.3.1CCK8法检测A549细胞增殖活力制备肺癌 A549细胞单细胞悬液,计数稀释每孔 5 103个细胞接种至96孔板后置于培养箱中培养过夜。肺岩宁方(0、12.5、25、50、100、200、400、800 g 1231 Modernization of Tradit
14、ional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 mL-1)干预细胞,并设置复孔。药物干预24 h后显微镜下观察拍摄不同浓度药物对A549细胞增殖的干预情况。弃上清,避光更换含10%CCK8的培养基,培养箱中孵育2 h后,多功能酶标仪下测定吸光度值,保存数据,计算各浓度药物对 A549 细胞的抑制率,抑制率(%)=(1-Drug intervention group/Control)group 100%,分析制图。1.3.2划痕实验检测A549细胞迁
15、移能力空白对照组、肺岩宁方组、肺岩宁+氯喹组用药预处理后的A549细胞以6孔板每孔30万个数接种,待细胞贴壁至 60-80%时用枪头划痕,PBS漂洗净飘起的细胞,加入培养基后再次置于培养箱中培养,按照0 h、24 h显微镜下取样拍照,计算迁移距离。对照组为不加药处理的A549细胞组。1.3.3Transwell实验检测A549细胞侵袭能力将配制好的 BD Matrigel基质胶按照一定比例加入Transwell上室,空白对照组、肺岩宁方组、肺岩宁+氯喹组预处理的A549细胞按每小室5万细胞量加入含基质胶的上室,下室加入高浓度血清的培养基,培养24 h后用棉签擦除未转移到膜下的细胞,4%多聚甲醛
16、固定30 min,漂洗后0.1%结晶紫染色10 min,漂洗后干燥,镜下观察拍照计数,计算侵袭率,细胞侵袭率=(药物组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数)*100%。1.3.4Western Blot 检测药物干预 A549 细胞蛋白表达水平细胞分为空白对照组和肺岩宁方组,将干预后的A549细胞收集,冰浴裂解,离心取上清备用,BCA法制定蛋白标曲,测定样本蛋白含量,制胶、上样、电泳、转膜、一抗(1 1000)4孵育过夜、二抗室温孵育2 h,运用Omni-ECL超灵敏化学发光检测试剂盒避光反应于PVDF膜1 min,置于化学发光成像系统中显影、拍照,-Actin作为内参,使用Image J软件进行灰度
17、值分析。1.3.5透射电子显微镜观察A549细胞自噬结构细胞分为空白对照组、肺岩宁方组,10 cm皿中以每皿80万细胞数量接种,培育细胞药物干预处理24 h后,消化收集在 2%戊二醛的 PBS固定液中固定 2 h,PBS漂洗2次,用含有1%锇酸的PBS固定液于冰上固定2 h,PBS漂洗两次,脱水置换,样品包埋制作枸橼酸铅电子染色切片,于透射电子显微镜下观察细胞自噬小体、自噬溶酶体结构拍照。1.4统计学方法采用统计分析系统SPSS 21.0对实验结果进行统计分析处理。计量资料:均数 标准差(x s),计数资料:用率描述。多组组间比较采用:完全随机设计的单因素方差分析(One-Way ANOVA)
18、。组间两两比较用:LSD进行分析。统计分析检验均采用双侧假设检验,检验水准=0.05,其中P 0.05为差异有统计学意义,P 0.01为差异有显著统计学意义。2 结果 2.1肺岩宁方对A549细胞增殖的影响Cell counting kit-8结果显示,浓度 0-800 g mL-1(0、12.5、25、50、100、200、400、800 g mL-1)肺岩宁方处理肺癌A549细胞24 h后,各浓度干预后细胞平均抑 制 率(%)分 别 为:0、24.14、30.97、36.30、42.86、49.45、62.76、78.29,x s分别为:0、1.9578、1.7802、1.9193、1.1
19、582、2.1226、5.3414、0.9014。与空白对照组(0 g mL-1)比较,A549细胞在各组肺岩宁方干预下增殖活力均受到抑制并呈现剂量依赖性,其中100、200、400、800 g mL-1浓度肺岩宁方干预增殖活力明显受到抑制(P 0.01),利用分析软件得出肺岩宁方对肺癌A549细胞IC50为200 g mL-1(图1)。以此为依据,本研究后续实验均选择200 g mL-1肺岩宁方进行课题药物干预处理。2.2 观察镜下A549细胞的增殖状态肺岩宁方干预 24 h后显微镜下观察 A549细胞,与空白对照组(0 g mL-1)比较,肺岩宁方干预后细胞形态改变,数量明显减少,可见细A
20、549细胞变小、变形、皱缩等生长抑制状态,并见有漂浮死亡细胞增多。图1CCK-8法检测不同浓度肺岩宁方处理24 h后A549细胞增殖能力(x s,n=3)注:与空白对照组比较,P 0.05,P 0.01。1232 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化专题讨论一:基于精亏脾虚理论中医药治疗恶性肿瘤临床与机理研究分析得出平均抑制率(%)为:0、50.5462,x s分别为:0、2.1226。与空白对照组比较,肺岩宁方干预后
21、 A549细胞增殖明显受抑制(图2)。肺岩宁方对肺癌A549细胞增殖活力具有明显影响(P 0.01)(图3)。2.3肺岩宁方对A549细胞迁移能力的影响划痕实验显示空白对照组、肺岩宁方组、肺岩宁+氯喹组干预A549细胞0 h时划痕距离为(mm):10.61 0.03、10.45 0.11、10.56 0.16,干预24 h后划痕距离为(mm):3.69 0.11、5.70 0.06、8.37 0.37。与空图2显微镜下观察肺岩宁方干预对A549细胞增殖的影响(200)图3肺岩宁方干预对A549细胞增殖的影响情况图4肺岩宁方对肺癌A549细胞迁移距离的影响1233 Modernization o
22、f Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 白对照组比较,肺岩宁方处理细胞迁移距离没有呈明显缩短趋势(P 0.05),A549细胞在FYN联合CQ的作用下迁移能力明显减弱(P 0.01),结果提示肺癌A549细胞在肺岩宁方干预下迁移能力可有效被抑制(图4、表5)。2.4肺岩宁方对A549细胞侵袭能力的影响Transwell实验显示,空白对照组、肺岩宁方组、肺岩宁+氯喹组分别干预细胞,利用软件分析统计侵袭细胞数量(个)分别为:52
23、1.67 12.66、341.76 4.51、322.33 8.73。与空白对照组比较,肺岩宁方干预A549细胞后透膜细胞明显减少(P 0.05),FYN联合CQ细胞侵袭力明显受抑制(P 0.05),结果提示A549细胞在肺岩宁方处理下侵袭能力可被有效的抑制(图5、表6)。2.5肺岩宁方对A549细胞自噬相关蛋白水平的影响利用 Western Blot 检测 A549 细胞自噬相关蛋白ATG5、LC3的表达情况显示,分析软件得出条带蛋白灰 度 值 比 分 别 为:ATG5/-Actin:1.9331 0.0883、1.3295 0.0991;LC3/-Actin:1.8727 0.0293、0
24、.6544 0.0437。与空白对照组比较,肺岩宁方干预A549肺癌细胞作用 24小时后,Atg5、LC3的表达量均有显著下调(P 0.01),提示肺岩宁方能够下调肺癌A549细胞自噬水平(图6、表7)。2.6透射电子显微镜观察A549细胞自噬结构肺癌 A549细胞本身有自噬现象,有自噬结构的表达可见;肺癌A549细胞在肺岩宁方干预下自噬结构明显减少(图7)。3 讨论 据2019年最新癌症统计分析,近十年内癌症死亡率每年下降1.4%(女性)和1.8%(男性),但预估1/4癌症死亡是由于肺癌导致,且统计肺癌的五年相对生存率对比各类癌病是极低的为19%12,因此肺癌的治疗及抗复发转移仍不容小觑。转
25、移是癌症患者发病和表5肺岩宁方对肺癌A549细胞迁移距离的影响(x s,n=3)组别空白对照组肺岩宁方组肺岩宁方+氯喹组划痕距离(mm)0 h10.61 0.0310.45 0.1110.56 0.1624 h3.69 0.115.70 0.06*8.37 0.37*注:*P 0.05,*P 0.01。图5肺岩宁方对A549细胞侵袭的影响(染色,200)表6肺岩宁方对A549细胞侵袭能力的影响(x s,n=3)组别空白对照组肺岩宁方组肺岩宁方+氯喹组侵袭细胞数(个)521.67 12.66341.67 4.51*322.33 8.73*注:*P 0.05,*P 0.01。图6肺岩宁方对A549
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 肺岩宁方介导 Atg5 肺癌 A549 细胞 调控 侵袭 转移 实验 研究