肺动脉高压实验模型的研究进展.pdf
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1、2023 年 9 月第 33 卷 第 9 期中国比较医学杂志CHINESE JOURNAL OF COMPARATIVE MEDICINESeptember,2023Vol.33 No.9谢锦程,肖梦媛,邓少东,等.肺动脉高压实验模型的研究进展 J.中国比较医学杂志,2023,33(9):79-89.Xie JC,Xiao MY,Deng SD,et al.Research progress in experimental models of pulmonary arterial hypertension J.Chin J Comp Med,2023,33(9):79-89.doi:10.39
2、69/j.issn.1671-7856.2023.09.010基金项目国家自然科学基金项目(81370242);广东医科大学学科建设项目(4SG21229GDGFY01);广东医科大学校级大学生创新创业训练计划项目(GDMU2021117,GDMU2021156);湛江市非资助科技攻关计划项目(2021B01145);湛江市科技计划项目(2022A01183)。作者简介谢锦程(1996),女,硕士研究生,研究方向:心血管内科研究。E-mail:xjcshieh 通信作者陈建英(1969),男,主任医师,硕士,研究方向:结构性心脏病。E-mail:jychen271 邓少东(1986),男,讲师
3、,博士,研究方向:中医药防治心脑血管疾病研究。E-mail:dengshaodong 共同通信作者肺动脉高压实验模型的研究进展谢锦程1,3,肖梦媛1,邓少东2,3,陈建英1(1.广东医科大学附属医院,广东 湛江 524001;2.广东医科大学附属东莞第一医院,广东 东莞 523710;3.广东医科大学第二临床医学院科研平台,广东 东莞 523808)【摘要】肺动脉高压是一种慢性进行性疾病,若不及时治疗,最终可导致右心衰竭甚至死亡。为了探讨肺动脉高压的发病机制,寻找有效的治疗方法,必需建立与发病机制相对应的实验模型。本文利用 Pubmed、ScienceDirect、Wiley 和 CNKI 检
4、索相关文献,系统地总结了近年来肺动脉高压实验模型的制备方法和研究进展,并对这些实验模型涉及的病理特征进行分类和探讨,以期为肺动脉高压的发病机制研究提供参考。【关键词】肺动脉高压;动物模型;细胞模型【中图分类号】R-33 【文献标识码】A 【文章编号】1671-7856(2023)09-0079-11Research progress in experimental models of pulmonary arterial hypertensionXIE Jincheng1,3,XIAO Mengyuan1,DENG Shaodong2,3,CHEN Jianying1(1.the Affili
5、ated Hospital of Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,China.2.the First Dongguan Affiliated Hospital,Guangdong Medical University,Dongguan 523710.3.Scientific Research Platform,the Second Clinical Medical College,Guangdong Medical University,Dongguan 523808)【Abstract】Pulmonary arterial hype
6、rtension is a chronic progressive disease that,if not treated promptly,can ultimately lead to right heart failure and even death.To explore the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension and develop more effective treatments,it is necessary to establish an experimental model corresponding to it
7、s pathogenesis.In this review,PubMed,ScienceDirect,Wiley,and CNKI were used to search the relevant literature.The establishment method and research progress of experimental models of pulmonary arterial hypertension in recent years were systematically summarized.Moreover,the pathological characterist
8、ics involved in these experimental models were classified and discussed to provide a reference to study the pathogenesis of pulmonary arterial hypertension.【Keywords】pulmonary arterial hypertension;animal model;cell modelConflicts of Interest:The authors declare no conflict of interest.肺动脉高压(pulmona
9、ry arterial hypertension,PAH)是一种严重的临床疾病,其组织病理特征是持续性的血管收缩、血管重构、血管周围炎症反应和纤维素样坏死,继而引发血管管腔狭窄和闭塞,导致肺血管阻力进行性增高,最终引起右心衰竭。流行病学显示,特发性和遗传性肺动脉高压发病率为每百万居民 5 例,患病率为每百万居民 25 例,并且呈现上升的趋势1。肺动脉高压患者的 1 年、3年、5 年和 7 年的生存率分别为 85%、68%、57%和49%,中位生存期约为 7 年2。尽管近年来国内外学者对肺动脉高压的发病机制研究取得了重要进展,但肺动脉高压仍然无法治愈,患者的 2 年和 3 年的死亡率仍高达 21
10、%3-5,这主要与其发病机制的复杂性有关。同时受临床标本的来源及伦理学的影响,围绕肺动脉高压发生发展机制的临床研究极具挑战性。而建立动物模型以及细胞模型可以全面了解肺动脉高压的病因和病理过程,便于进行新型药物和干预手段的筛选和研究。因此,选择合适的实验模型是探索肺动脉高压发病机制及其药物治疗研究的基础。本文旨在总结近年来肺动脉高压实验模型的建模方法,比较各种模型的优缺点,为肺动脉高压发病机制的探索和临床研究提供参考。1 动物模型1.1 野百合碱诱导肺血管内皮细胞损伤模型 野百合碱(monocrotaline,MCT)是一种具有致突变和致癌功效的吡铬里西啶生物碱,可从豆类植物和野猪粪便中提取获得
11、。研究表明,野百合碱在体内被肝代谢产生具有肺毒性的野百合碱吡咯(MCTP),进而损伤血管内皮细胞,导致肺动脉高压6。在构建野百合碱模型时,最常选择的实验动物为大鼠,通过单次腹腔或者皮下注射 MCT(通常剂量为 60 80 mg/kg)来诱发肺动脉高压7-8。由于腹腔内腹膜面积大、吸收快,使用腹腔注射野百合碱可能会使大鼠死亡率升高,因此建模时多采用皮下注射野百合碱。在注射野百合碱后的 56 周内,约有一半大鼠会死亡,为了提高模型大鼠的成活率,Zhuang 等9对经典野百合碱模型进行了改进,采用腹腔注射两次 MCT(剂量为 20 mg/kg)的建模方案,两次注射之间间隔 7 d,该建模方案可减轻模
12、型大鼠心脏组织的受损,降低其血管周围的炎症反应水平以及心肌细胞纤维化的程度,从而显著提高模型大鼠的存活率10。与大鼠相比,单次注射野百合碱并不能在小鼠体内引发肺动脉高压。即使直接注射足够剂量的 MCTP 也难以重现野百合碱在大鼠体内诱导的肺血管肌化以及右心室收缩压明显升高的症状,这可能与小鼠代谢野百合碱的方式有关11。而建立小鼠肺动脉高压模型的方法,常采用每周皮下注射 MCT(剂量为 600 mg/kg),持续 48 周12。该模型建模周期长且耗费多,因此大鼠是建立野百合碱诱导模型的首选实验动物。大鼠注射野百合碱后,通常不会立即出现肺动脉高压的临床症状,而是在 3 4 周后出现呼吸困难、哮鸣音
13、、口鼻腔出血等症状。解剖观察显示,大鼠的右心室明显肥大和扩张,右心室游离壁显著增厚13-16。野百合碱引起的病理性改变包括内皮功能障碍和平滑肌细胞的增殖,进而导致血管重构、血管周围炎症以及心肌纤维化17-19。研究显示,野百合碱会损害肺动脉内皮细胞,引起内皮功能障碍,继而增加血管收缩剂包括内皮缩血管肽 1、血管紧张素、血栓素 A2 的表达水平。同时 NO 和前列环素等血管扩张素的合成减少,随后 TGF-smad 和BMPR-2 信号通路被激活,导致血管收缩和血管重塑增加7,20-22。关于野百合碱模型的研究显示,炎症细胞(巨噬细胞、树突细胞、淋巴细胞和肥大细胞)和细胞因子在肺血管重塑早期阶段起
14、关键作用23-24。在大鼠注射野百合碱的第 1 周,仅有肿瘤坏死因子-、白介素-1 升高,表明此时处于急性炎症期。随后,在慢性炎症期,促炎因子如肿瘤坏死性因子-、白介素-1、白介素-6、白介素-12 和抗炎因子精氨酸酶 1、白介素-10、肿瘤坏死因子-水平升高。随着肺动脉高压的发展,PI3K/Akt 信号通路表达上调,并与促炎蛋白相关。此外,NF-B 信号通路也被激活,这也在一定程度上揭示了野百合碱诱导肺动脉高压的炎症特征25。野百合碱模型具有价格低廉、技术要求低的特点,可帮助我们全面了解肺血管重塑的过程以及其病理生理的机制。根据最近研究显示,中药化合物(木犀草素、柚皮苷、黄芩素)、磷酸二酯酶
15、 5 抑制剂(西地那非)、Rho 激酶抑剂(Y-27632、法舒地尔)、钠葡萄糖协同转运蛋白 2 抑制剂(达格列净)、内皮素受体拮抗剂(波生坦、哌拉西坦)、选择性 5-羟色胺再摄取抑制剂(氟西汀)、靶向小分子抑制剂(Seralutinib),均能改善野百合碱诱导的肺动脉高压症状26-34。同时,野百合碱还具有广泛毒性,常引起肝损伤、肾功能不全、肺部纤维化等症状35-37。综上所述,野百合碱模型常用作肺动脉高压药物筛选研究的首选动物模型。1.2 经典缺氧模型 采用慢性缺氧诱导肺动脉高压动物模型,常用08中国比较医学杂志 2023 年 9 月第 33 卷第 9 期 Chin J Comp Med,
16、September 2023,Vol.33,No.9的实验动物为大鼠和小鼠。造模时,将动物置于10%O2低氧舱中,持续 34 周,即可建立缺氧性肺动脉高压模型38-39。研究显示,将 Sprague-Dawley大鼠和 C57BL/6 小鼠同时暴露于低压缺氧中 13周后,两种动物都表现出肺动脉高压的相关症状,但 C57BL/6 小鼠的肺血管重塑程度和肺动脉的压力均低于 Sprague-Dawley 大鼠40。另外,将 3 月龄的雄性大鼠和 1214 月龄的雄性大鼠暴露于慢性缺氧环境(置于海拔 5486 m),持续时间为 142 d。结果显示,在缺氧期间,3 月龄大鼠表现出血管肌化的特征,而 1
17、214 月龄大鼠的血管形态几乎未发生变化41。提示慢性缺氧引起肺血管结构改变的过程与物种或动物的发育阶段显著相关42。慢性缺氧引起的结构改变包括肺泡壁非肌化血管中平滑肌样细胞和成纤维细胞的聚集和分化、单核细胞/祖细胞的募集以及内皮-间充质转化42-44。此外,肺动脉平滑肌细胞在缺氧条件下会显著肥大,并参与内膜增厚的发展45。动物在急性和慢性的缺氧环境中会增加肺部的炎症细胞因子、趋化因子和粘附分子的表达,并导致白细胞在肺和肺血管内及周围集聚。白介素-1、白介素-6 和肿瘤坏死因子-等炎性因子的上调介导肺动脉平滑肌细胞的增殖,促进肺动脉高压中血管重塑46-49。一旦动物离开缺氧环境并恢复至常压氧条
18、件,上述变化中的大部分可以逆转。因此,缺氧模型仅适用于研究非严重程度的肺动脉高压类型。为了进一步改进模型,Coste 等50将慢性缺氧与野百合碱相结合,即将大鼠腹腔注射 MCT(剂量为 60 mg/kg)后置于 380 mmHg 的低压舱中 3 周。研究结果显示,大鼠出现了严重动脉病变,包括血管的炎症、血管重塑和血栓性、严重的内膜病变和早期的丛状病变,这些组织学特征与肺动脉高压患者肺部的组织学特征相似。1.3 Sugen 5416/缺氧模型 Sugen 5416 是一种 3-吲哚-2-酮化合物,其主要作用是拮抗血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶1/2(VEGFR1、VEGFR2)、抑制血管生成,可
19、使实验动物产生肺动脉高压。通过给大鼠单次皮下注射Sugen 5416(剂量为 20 mg/kg),随后置于常压常氧条件下饲养 5 周,即可观察到肺动脉高压症状51。当将 Sugen 5416 与慢性缺氧暴露联合应用,即单次注射 Sugen 5416 后继续进行慢性缺氧暴露 3 周,可诱导出现更为严重的肺动脉高压症状52。小鼠需要持续暴露于 10%O2的环境下,并每周腹腔注射 1次 Sugen 5416(剂量为 20 mg/kg),给药持续 3 周,才可建立 Sugen 5416/缺氧模型53。Sugen 5416/缺氧诱导的肺动脉高压主要的组织学特征为肺动脉内皮细胞和肺血管平滑肌细胞的过度肥大
20、/增殖。Sugen 5416 可直接抑制血管内皮生长因子介导的内皮细胞增殖,从而形成闭塞性丛状病变54。与单纯慢性缺氧模型不同,Sugen 5416/缺氧模型的病变是不可逆转的55。在 Sugen 5416/缺氧模型的基础上,进一步改进得到了 Sugen 5416/缺氧/常氧模型。该模型动物在单次注射 Sugen 5416 后经过低压缺氧 3 周,然后恢复到常压氧环境下饲养 10 周56-57。Sugen 5416/缺氧/常氧模型组动物的右心室游离壁/左心室+隔膜重量比在第 1 周即显著升高,小动脉开始出现不同程度的阻塞,随后经过 10 周的复氧,形成了严重复杂闭塞性丛状病变形成56。该模型诱
21、导的肺动脉高压与人类肺动脉高压的特征十分相似。Sugen 5416 具有特异性结合内皮细胞的能力,并通过在持续抑制血管内皮生长因子受体发挥作用。Sugen 5416 可抑制 VEGFR、TGF-1/Smad2/Smad3、MAPK、BMPR2、HIF-1、Rho 激酶,同时激活右心室巨噬细胞募集以及炎症反应调节因子 NF-B的表达。这导致内皮细胞和平滑肌细胞的无序增殖,并引起肺内血管周围炎症细胞的聚集,这些因素共同促成严重的血管阻塞性和丛状病变的发生58-63。然而,这些症状与物种和性别存在密切关联。研究显示,雌性大鼠的雌激素和孕激素能够减少 Sugen 5416 引起的内皮细胞凋亡,从而降低
22、发生肺动脉高压的风险64。另外,在建立 Sugen 5416/缺氧/常氧小鼠模型时采用了类似 Sugen 5416/缺氧/常氧大鼠肺动脉高压模型的方案。小鼠在模型中表现出肺动脉压升高和肺小动脉内侧壁增厚等肺动脉高压的症状,但没有明显的肺血管闭塞性病变,也缺乏与大鼠模型和晚期肺动脉高压患者相似的右心室衰竭和血管重塑65。相比之下,Sugen 5416/缺氧/常氧大鼠模型更具有与人类肺动脉高压相似的严重肺动脉高压症状。因此该模型被广泛应用于研究肺动脉高压,并被认为是最常用的啮齿动物模型之一。近年来,与 Sugen 5416 相关的双击模型不断出现。其中,无胸腺(T 细胞缺陷)的大鼠只需单剂量Sug
23、en 5416 即可诱发严重的肺动脉高压,并且其炎18中国比较医学杂志 2023 年 9 月第 33 卷第 9 期 Chin J Comp Med,September 2023,Vol.33,No.9症程度更为严重66。另一种模型是使用 Sugen 5416 联合左肺切除术,在大鼠体内诱导血管闭塞性肺动脉高压。该模型表现出的症状与细胞增殖和促凋亡信号通路的激活相关67-68。此外,单次皮下注射 Sugen 5416(剂量为 20 mg/kg)联合腹腔持续注射吗啡(剂量为 10 mg/kg)35 d,也能诱发大鼠出现肺动脉高压。吗啡的使用会加重 Sugen 5416 引起的肺动脉高压症状,包括近
24、端血管平滑肌的肥大、内膜病变以及右心室肥大69。1.4 血吸虫模型 与肺动脉高压相关的寄生虫病中,最常见为血吸虫病。血吸虫病可由曼氏血吸虫和日本血吸虫引起,并可导致血吸虫性肺动脉高压(chistosomiasis-induced pulmonary arterial hypertension,SchPAH)70。相对于雄性小鼠,雌性小鼠对血吸虫的感染更为敏感,因此常使用雌性 C57/BL6 成年小鼠作为模型动物。建立 SchPAH 模型的方法是使用含有曼氏血吸虫 75100 个尾蚴(用于亚急性研究)或 30 个尾蚴(用于慢性研究)的混悬液经皮感染。在亚急性研究中,小鼠的肺部几乎没有虫卵以及肺血
25、管重塑的出现。但在慢性感染的研究中,建模 12周后小鼠出现明显的肺血管重塑,并伴有血管周围炎症以及丛状病变。然而,亚急性感染和慢性感染研究中,右心室收缩压或右心室游离壁/左心室+隔膜比率并未升高71。Graham 等72对血吸虫模型进行了改进,首先,将小鼠的尾巴放入含有 3035 个尾蚴的烧瓶中,经皮感染持续30 min。55 d 后,将悬浮在0.5 mL 无菌盐水的 5000 个活卵通过尾静脉注射进入小鼠体内,以此对小鼠进行静脉内攻击。虫卵的静脉攻击模拟慢性感染中小鼠形成侧支分流,并使虫卵通过侧支分流沉积在肺部这一过程。Kumar 等73在此基础上对模型进一步改进,首先使用血吸虫卵(每克体重
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