高效液相色谱分析土壤氨基糖的质量控制方法.pdf
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1、土 壤(Soils),2023,55(5):11521159 基金项目:国家重点研发计划重点专项(2019YFE0126500),中国科学院仪器设备功能开发技术创新项目(E1R10150Y)和河北省高等学校科学技术研究项目(BJK2022016)资助。*通讯作者()作者简介:杨洋(1991),女,黑龙江哈尔滨人,博士,研究方向为生态系统生态学。E-mail:yangyang_ http:/ DOI:10.13758/ki.tr.2023.05.027 杨洋,张心昱,张应华,等.高效液相色谱分析土壤氨基糖的质量控制方法.土壤,2023,55(5):11521159.高效液相色谱分析土壤氨基糖的质
2、量控制方法 杨 洋1,4,张心昱2,3*,张应华2,于颖超2,3,董欣妮2(1 河北建筑工程学院市政与环境工程系,河北张家口 075000;2 中国科学院地理科学与资源研究所生态系统网络观测与模拟重点实验室,北京 100101;3 中国科学院大学资源与环境学院,北京 100101;4 河北省水质工程与水资源综合利用重点实验室,河北张家口 075000)摘 要:利用邻苯二甲醛(OPA)柱前在线衍生高效液相色谱法测定了土壤中 4 种氨基糖,即胞壁酸(MurN)、甘露糖(ManN)、氨基半乳糖(GalN)和氨基葡萄糖(GluN)的含量,并从样品出峰、理论塔板数、信噪比、检出限、定量限、样品的重复性、
3、标准样品的线性和加标回收率方面评估了检测过程中仪器和方法的灵敏度、精密度和准确度。结果表明:检测过程中,4 种氨基糖的出峰先后顺序为胞壁酸、甘露糖、氨基半乳糖和氨基葡萄糖;4 种氨基糖的色谱峰峰形好,相邻两峰的分离度1.5,相邻两峰能够完全分离;理论塔板数2 000,色谱柱的柱效高;胞壁酸、甘露糖、氨基半乳糖和氨基葡萄糖的仪器检出限分别为 0.030、0.300、0.150和 0.150 mol/L,仪器定量限分别为 0.100、1.000、0.500 和 0.500 mol/L,方法检出限分别为 0.010、1.500、0.100 和 0.100 mol/L,方法定量限分别为 0.030、5
4、.000、0.300 和 0.300 mol/L;除 0 10 cm 以下土层中的甘露糖外,其他土壤样品中氨基糖的信噪比均10,仪器和方法的灵敏度高;氨基糖样品含量的重复性(标准样品平行样、土壤样品平行样和土壤样品重复样的相对标准偏差均0.997 0)良好,空白加标回收率和土壤基质加标回收率为 80%94%,仪器和方法的准确度较高。总之,利用 OPA 柱前在线衍生高效液相色谱法测定土壤氨基糖含量的分析方法操作简单、灵敏度高,能够精确地测定土壤中的氨基糖含量。关键词:OPA 柱前在线衍生;微生物残体;灵敏度;精密度;准确度 中图分类号:S151.9+5 文献标志码:A Quality Contr
5、ol for Determining Amino Sugar Contents in Soil by High Performance Liquid Chromatography YANG Yang1,4,ZHANG Xinyu2,3*,ZHANG Yinghua2,YU Yingchao2,3,DONG Xinni2(1 Department of Municipal and Environmental Engineering,Hebei University of Architecture,Zhangjiakou,Hebei 075000,China;2 Key Laboratory of
6、 Ecosystem Network Observation and Modeling,Institute of Geographic Sciences and Natural Resources Research,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China;3 College of Resources and Environment,University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China;4 Hebei Key Laboratory of Water Quality E
7、ngineering and Comprehensive Utilization of Water Resources,Zhangjiakou,Hebei 075000,China)Abstract:Four amino sugars,namely,muramic acid(MurN),mannosamine(ManN),galactosamine(GalN)and glucosamine(GluN),in soil were determined by ortho-phthalaldehyde(OPA)pre-column derivatisation-high performance li
8、quid chromatography(HPLC).The sensitivity,precision and accuracy of the instrument and method were tested from chromatographic peaks,theoretical plates,signal-noise(S/N)ratio,limits of detection and quantification,sample content repeatability,standard linearity,and recovery.The results showed that t
9、he chromatographic peak orders of the four amino sugars were MurN,ManN,GalN and GluN.The chromatographic peak shapes were good and the resolutions of each two adjacent peaks were 1.5,indicating that the two adjacent peaks were completely separated.Theoretical plates were 2 000,indicating high chroma
10、tographic column efficiency.The instrument detection limits of MurN,ManN,GalN and GluN were 0.030,0.300,0.150 and 0.150 mol/L,the instrument quantitative limits were 0.100,1.000,0.500 and 0.500 mol/L,the method detection limits were 0.010,1.500,0.100 and 0.100 mol/L,and the method quantitative limit
11、s were 0.030,5.000,0.300 and 0.300 mol/L,respectively.第 5 期 杨洋等:高效液相色谱分析土壤氨基糖的质量控制方法 1153 http:/ In addition to ManN in the soil below 10 cm,S/N ratios of the amino sugars amount were all 10,indicating high sensitivity of the instrument and method.The relative standard deviations of the amino sugar
12、amount in the parallel standard samples,parallel soil samples and repeated soil samples were all 0.997 0,and the recovery rates of blank and soil substrate were between 80%and 94%,indicating high accuracy of the instrument and method.In conclusion,the method for the determination of soil amino sugar
13、 content by OPA pre-column derivatisation-HPLC,which is simple in operation and high in sensitivity,could accurately determine the contents of amino sugar in soils.Key words:OPA pre-column derivatisation;Microbial necromass;Sensitivity;Precision;Accuracy 氨基糖在土壤有机碳和有机氮含量中的占比分别为 2%5%1和 5%12%2-3。由于植物不含
14、氨基糖,土壤动物只向土壤贡献少量的氨基糖,因此土壤中的大部分氨基糖被认为主要来自微生物4-5。氨基糖作为微生物死亡残体的生物标志物被广泛测定。目前可被定量分析测定的土壤氨基糖主要有 4 种:胞壁酸(MurN)、甘露糖(ManN)、氨基半乳糖(GalN)和氨基葡萄糖(GluN)6-8。其中,胞壁酸和氨基葡萄糖是微生物细胞壁残留物,胞壁酸只存在于细菌细胞壁中,氨基葡萄糖来自于细菌和真菌细胞壁,而甘露糖和氨基半乳糖的来源尚不清楚6,9-10。氨基糖具有异源性,可作为微生物残留物标识物用于评估土壤中不同 微生 物死亡 残体 有机碳 的含 量。Appuhn 和Joergensen5确定了将真菌氨基葡萄糖
15、转化为真菌残体碳的平均转化系数为 9,将细菌胞壁酸转化为细菌残体碳的平均转化系数为 45。由于土壤微生物残体碳的周转时间比微生物活体碳更长,对土壤中稳定性碳库的形成具有重要贡献11-12。因此,精确地测定土壤氨基糖含量对于评估微生物对土壤有机碳的贡献具有重要意义。国内外针对土壤氨基糖含量的分析测定方法开展了大量的研究。早期分析氨基糖的方法有电化学法13、光度法14和电泳法15等。这些方法由于受样品杂质影响大,对复杂环境样品分析受限。目前,常用的分析方法有气相色谱法7、液相色谱法8,16、红外光谱法17和气质联用法18。这些方法所采用的前处理方法和检测技术各不相同。气相色谱法前处理过程繁琐,且需
16、要手动进行衍生化处理。红外光谱法虽具有结构定性方面的优势,但灵敏度较低9,19。气质联用法具有定性、可靠性和灵敏度高的特点,但是由于成本太高,因而没有被广泛应用。高效液相色谱法采用自动进样器用户模式进行邻苯二甲醛(OPA)在线衍生的方法,操作简单方便16。Indorf 等8分析了激发波长、OPA 反应时间、四氢呋喃浓度和流动相 pH 对氨基糖分离的影响,对高效液相色谱法进行优化,使高效液相色谱法具有检出限低、灵敏度和准确度高等特点,从而使该方法得以广泛应用。关于土壤氨基糖的分析测定多从检出限、定量限、标准曲线的线性、样品的重复性、加标回收率这几个方面考虑方法的质量控制。例如,Zhang 和Am
17、elung7报道了气相色谱法分析氨基糖的仪器定量限、标准样品线性、样品含量的相对标准偏差和土壤基质加标回收率。Dick 等20和 Zhang 等17报道了红外光谱法分析氨基糖的标准样品线性。近年来,国内根据 Indorf 等8的方法,建立了高效液相色谱分析土壤氨基糖的方法。一种分析方法的好坏不仅要考虑仪器的灵敏度、精密度和准确度,同时也要考虑包括前处理在内的方法的灵敏度、精密度和准确度21。Indorf 等8通过仪器检出限和定量限检验了高效液相色谱法分析氨基糖样品过程中仪器的灵敏度,通过标准样品线性检验了仪器的准确度,通过空白加标回收率检验了仪器和方法的准确度,但是未见包括前处理在内的整个氨基
18、糖分析流程中仪器和方法精密度的质量控制。本研究利用 OPA 柱前在线衍生高效液相色谱法结合荧光检测器分析红壤剖面中具有不同氨基糖含量的土壤样品22,利用信噪比、检出限、定量限反映仪器和方法的灵敏度,利用标准样品平行样、土壤样品平行样和土壤样品重复样的重复性反映仪器和方法的精密度,利用标准样品的线性和加标回收率反映仪器和方法的准确度,以为 OPA 柱前在线衍生高相液相色谱法测定土壤氨基糖含量的质量控制提供依据。1 材料与方法 1.1 仪器和色谱条件 高效液相色谱仪(Ultimate 3000,Thermo Fisher,USA),包 括 带 脱 气 单 元 的 低 压 四 元 梯 度 泵(LPG
19、-3400SD Pump)、自 动 进 样 器 (WPS-3000 Sampler)、柱温箱(TCC-3000 Column Compartment)、荧光检测器(FLD-3100 Detector)以及变色龙色谱1154 土 壤 第 55 卷 http:/ 数据处理系统(Chromeleon 7.1.0.898 CDS)。4 种氨基糖的分离在十八烷基硅烷化硅胶柱(Acclaim120 C18;150 mm 4.6 mm,5 m;Thermo Fisher Scientific,USA)中进行。柱温箱的温度设置为35 C,荧光检测器的灵敏度设为 1,激发波长和发射波长分别设置为 330 nm
20、和 445 nm,流通池温度设置 为 45 C8。由于需要高进样精度和有效的外部针头清洗以消除残留,因此使用专为自动柱前衍生化而设计的自动进样器。衍生过程中,启动自动进样器的用户模式(表 1),自动进样器会自动加入 5 L OPA 衍生溶液和3 L 氨基糖样品,衍生化 120 s 后进样。表 1 高效液相色谱仪测定土壤氨基糖含量自动进样器的用户自定义程序 序号 命令 参数 1 UdpDraw Air,1 L,GlobalSpeed,GlobalHeight 2 UdpDraw ReagentAVial,5 L,GlobalSpeed,GlobalHeight 3 UdpDraw SampleV
21、ial,3 L,GlobalSpeed,GlobalHeight 4 UdpDraw Air,8 L,GlobalSpeed,GlobalHeight 5 UdpMoveSyringe Unload=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed 6 UdpMoveSyringe Load=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed 7 UdpMoveSyringe Unload=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed 8 UdpMoveSyringe Load=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed 9 UdpMoveSyringe
22、 Unload=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed 10 UdpMoveSyringe Load=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed 11 UdpMoveSyringe Unload=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed 12 UdpMoveSyringe Load=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed 13 UdpMoveSyringe Unload=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed 14 UdpMoveSyringe Load=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed
23、 15 UdpMoveSyringe Unload=8 L,SyringeSpeed=GlobalSpeed 16 UdpMixWait 120 s 17 UdpInjectMarker 18 UdpInjectValue Inject 19 UdpSyringeValue Waste 20 UdpMoveSyringeHome GlobalSpeed 21 UdpDraw Wash,100 L,GlobalSpeed,GlobalHeight 22 UdpDispense Drain,100 L,GlobalSpeed,GlobalHeight 流动相由 A(甲醇/超纯水,1/1,V/V)和
24、 B(柠檬酸缓冲溶液/甲醇/四氢呋喃,95/2/3,V/V/V)组成23。氨基糖分离过程中流动相 A 和流动相 B 的体积比为5/95,流速为 1.5 mL/min,流动相的梯度洗脱条件(表2)参考 Mou 等23。表 2 流动相的梯度洗脱条件 时间(min)流动相 A(%)流动相 B(%)0 5 95 19 5 95 21 80 20 24 80 20 25 5 95 30 5 95 1.2 试剂 供试试剂:甲醇,色谱纯,购自 Fisher Scientific公司;硼酸、50%的氢氧化钠、二水合柠檬酸三钠、无水乙酸钠、盐酸,均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;四氢呋喃(色谱纯)、2-
25、巯基乙醇、邻苯二甲醛(OPA)和 4 种氨基糖标准样品胞壁酸、甘露糖胺盐酸盐、半乳糖胺盐酸盐和葡萄糖胺盐酸盐,均购买自 Sigma 公司。1.3 溶液的配制 所用溶液均采用超纯水机(Integral 10,默克Milli-Q,USA)制备的超纯水配制。将 25 g 硼酸溶解于 900 mL 超纯水中,用 50%的氢氧化钠将溶液 pH调节至 11,最后用超纯水定容至 1 L 制备 0.4 mol/L硼酸缓冲溶液。将 2.5 mL 2-巯基乙醇加到 100 mL 硼酸缓冲溶液中混匀,制备还原溶液。将 5 mg 邻苯二甲醛溶解于 0.4 mL 甲醇、0.4 mL 还原溶液和 8 mL硼酸缓冲溶液中,
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