葛根素治疗冠状动脉支架内再狭窄的核心靶点筛选与细胞学验证.pdf
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1、山东医药2023 年第 63 卷第 26 期葛根素治疗冠状动脉支架内再狭窄的核心靶点筛选与细胞学验证孙云雷1,曹月娟2,赵振营31 天津中医药大学研究生院,天津300000;2 天津市人民医院心内二科;3 天津市人民医院药学部摘要:目的基于网络药理学、分子对接的方法筛选葛根素治疗冠状动脉支架内再狭窄(ISR)的核心靶点,并通过细胞学实验验证相关靶点。方法在NCBI公共数据平台基因表达综合数据库(GEO)中下载基因表达谱芯片数据GSE46560,使用R语言软件筛选该基因表达谱的差异基因,与Genecard数据库中ISR相关靶点整合,获得ISR疾病靶点。在TCMSP、SwissTargetPred
2、iction网站下载葛根素的作用靶点,与ISR疾病靶点交集,获得药物疾病关键靶点;使用String网站和Cytoscape软件分析蛋白蛋白相互作用网络并筛选出核心靶点;使用AutoDockvina软件将核心靶点与葛根素的三维核心活性成分结构进行分子对接,计算分子对接核能值,评价配体分子与受体蛋白的结合能力。取大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞进行培养,将细胞分为空白对照组、Ang组、Ang+葛根素组,采用细胞划痕实验观察各组6、12、24、48 h细胞迁移率;采用Western blotting法检测各组细胞过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)表达;采用ELISA法检测细胞炎症因子肿瘤坏死因子(TN
3、F-)、白细胞介素6(IL-6)含量。结果共获得ISR疾病相关靶点528个、葛根素作用靶点142个,将二者取交集,获得药物疾病关键靶点56个。将56个疾病药物关键靶点输入String11.5网站,获得疾病药物核心靶点TNF、AKT1、SOD1、VEGFA、ABCB1、CASP3、PTGS2、PPAR。分子对接显示,各核心靶点蛋白与葛根素中对应的活性化合物均有较好的结合能力。细胞实验表明,与空白对照组比较,Ang组PPAR蛋白表达降低,TNF-、IL-6表达升高;与Ang组比较,Ang+葛根素组PPAR表达升高,TNF-、IL-6表达降低。结论共筛选得到PPAR等7个葛根素治疗ISR的核心靶点;
4、经验证,葛根素可能通过激活PPAR、抑制炎症因子表达从而抑制血管平滑肌细胞增殖,从而达到治疗ISR的目的。关键词:冠脉支架内再狭窄;葛根素;网络药理学;过氧化物酶体增殖物激活受体;血管平滑肌细胞;细胞增殖doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2023.26.003 中图分类号:R541.4 文献标志码:A 文章编号:1002-266X(2023)26-0010-05Screening and cytological validation of core targets of puerarin in the treatment of coronary in-stent res
5、tenosisSUN Yunlei1,CAO Yuejuan,ZHAO Zhenying1 Graduate School of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300000,ChinaAbstract:Objective Based on the methods of network pharmacology and molecular docking,the core targets of puerarin in the treatment of coronary in-stent restenosis(
6、ISR)were screened,and the related targets were verified by cytological experiments.Methods The gene expression profile data GSE46560 was downloaded from the NCBI public data platform gene expression comprehensive database(GEO).The differential genes of the gene expression profile were screened by R
7、language software,and were integrated with ISR-related targets in Genecard database to obtain ISR disease targets.We downloaded the action target of puerarin on TCMSP and SwissTargetPrediction websites and intersected with ISR disease target to obtain the drug-disease key target.We used String websi
8、te and Cytoscape software to analyze the protein-protein interaction network and screened the core target;AutoDockvina software was used to dock the core target gene with the three-dimensional core active component structure of puerarin,and we calculated the docking nuclear energy,and evaluated the
9、binding ability of ligand molecule and receptor protein.The vascular smooth muscle cells of rat thoracic aorta were 基金项目:天津市“131”创新型人才培养工程项目(2016)。第一作者简介:孙云雷(1996-),男,硕士研究生在读,主要研究方向为中西医结合治疗心血管疾病。E-mail:通信作者简介:曹月娟(1975-),女,教授,主任医师,硕士研究生导师,主要研究方向为心血管疾病防治。E-mail:开放科学(资源服务)标识码(OSID)10山东医药2023 年第 63 卷第 2
10、6 期cultured and divided into the blank control group,Ang group,and Ang+puerarin group.The cell migration rates at 6,12,24 and 48 h were observed by Scratch test,and the expression of peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)was detected by Western blotting.The content of tumor necrosis facto
11、r-(TNF-)and interleukin-6(IL-6)was measured by ELISA.Results A total of 528 ISR disease-related targets and 142 puerarin action targets were obtained,and 56 drug-disease key targets were obtained by intersection of the two.Fifty-six disease-drug key target genes were input into String11.5 website to
12、 obtain disease-drug core targets TNF,AKT1,SOD1,VEGFA,ABCB1,CASP3,PTGS2,and PPAR.Molecular docking showed that all the core target proteins had good binding ability to the corresponding active compounds in puerarin.Cell experiments showed that compared with the blank control group,the expression of
13、PPAR protein decreased and the expression of TNF and IL-6 increased in the Ang group,while the expression of PPAR increased and TNF-and IL-6 decreased in the Ang+puerarin group in comparison with those of the Ang group.Conclusion Seven core target genes of puerarin in the treatment of ISR are screen
14、ed out,and puerarin can inhibit the proliferation of vascular smooth muscle cells by activating PPAR and inhibiting the expression of inflammatory factors to achieve the purpose of treating ISR.Key words:coronary in-stent restenosis;puerarin;network pharmacology;peroxisome proliferator-activated rec
15、eptor;vascular smooth muscle cell;cell proliferation经皮穿刺冠状动脉介入是冠心病患者血运重建的重要手段,然而冠脉支架内再狭窄(ISR)以及由此引发的再次靶血管血运重建严重影响介入治疗的长期预后。血管平滑肌细胞(VSMC)迁移和增殖在ISR的病理生理学中发挥关键作用。介入操作对血管壁的机械刺激和血管壁内皮损伤后,可诱发表达多种炎症介质和细胞因子,促使血管中层VSMC发生表型转化并获得增殖能力,VSMC增殖并向内膜移行,伴有细胞外基质的改变,导致新生内膜形成并增厚,发生不良的血管结构重塑,从而使血管腔缩小甚至完全闭塞1。抑制VSMC迁移和增殖能够
16、有效减少ISR发生。研究显示,血管紧张素(Ang)能够促进VSMC迁移和增殖,加快ISR的发生,其机制可能与 NF-B、PI3K/AKT、MAPK 等炎症信号通路有关2。葛根素是从中药葛根中提取的一种黄酮苷,主要用于治疗心脑血管疾病、糖尿病周围血管疾病、颈椎病、肺心病等。现代药理学研究发现,葛根素能够扩张血管,降低心肌耗氧指数,改善心肌缺血,在心脑血管疾病中发挥良好的临床疗效;葛根素还能抑制二磷酸腺苷、提高高密度脂蛋白水平,降低血栓形成风险3。葛根素在心脑血管疾病中的作用可能与其调控炎症因子和炎症通路的作用有关4。2022年3月2023年2月,我们基于网络药理学和分子对接技术,筛选葛根素治疗I
17、SR的核心靶点,并通过细胞学实验验证相关靶点的作用及其机制,旨在为临床预防和治疗ISR提供新的思路。1 材料与方法 1.1葛根素治疗ISR核心靶点的筛选1.1.1ISR疾病靶基因的筛选在NCBI公共数据平台基因表达综合数据库(GEO)(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载基因表达谱芯片数据GSE46560,使用R4.2.1软件对该芯片数据进行分析,将差异倍数logFC绝对值1和P0.05的基因作为ISR的差异表达基因,即ISR潜在治疗靶点,结果以火山图形式展示。另外,在 GeneCards数据库(https:/www.genecards.org/)中输入“i
18、n-stentrestenosis”进行检索,下载并收集获得的ISR相关基因。将两个数据库收集的ISR疾病相关靶基因汇总、去重,获得ISR疾病靶基因。1.1.2葛根素作用靶点的筛选在TCMSP数据库(https:/old.tcmsp- 数据库(http:/www.swisstargetprediction.ch/)中输入葛根素化学式,物种选择“Homo sapiens”,下载葛根素相关靶点。将两个数据库收集的葛根素靶点汇总、去重,获得葛根素作用靶点。1.1.3疾病药物关键靶点的筛选通过Uniprot网站(https:/www.uniprot.org/)对收集到的ISR、葛根素靶点进行名称标准化
19、校正,再将ISR、葛根素靶点输入 Venn Diagrams 在线网站(https:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)获得交集靶点,即疾病药物关键靶点。1.1.4疾病药物核心靶点的筛选将获得的疾病药物关键靶点输入String11.5网站,选择物种为“Homo sapiens”,设置“highest confidence”为 0.4,删除无相互作用节点,构建蛋白蛋白相互作用网络(PPI)图,并运用Cytoscape3.9.1软件分析PPI图,计算各个靶点的Betweenness值,取Betweenness值100的靶点作为疾病药物核心靶点,绘
20、制可视化图。1.1.5疾病药物核心靶点的分子对接将11山东医药2023 年第 63 卷第 26 期“1.1.4”筛选获得的核心靶点输入 PCSBPDB 网站(https:/www.rcsb.org/),同时将葛根素结构输入Chem 3D 20.0软件,获得各靶点与葛根素的三维核心活性成分结构。使用Pymol软件去除靶点的小分子配体和水分子,使用 AutoDockTools1.5.7软件加氢,使用Gridbox包裹整个靶点,再使用AutoDockvina软件进行分子对接,使用Pymol绘制可视化图片。分子对接核能值-5.0 kcal/mol表明配体分子与受体蛋白有较好的对接活性,-7.0 kca
21、l/mol表明二者间有强烈的对接活性。1.2葛根素抑制VSMC增殖机制的细胞学验证1.2.1材料大鼠胸主动脉VSMC(天津市胸科医院)、葛根素(Sigma)、Ang(Med Chem Express)、过氧 化 物 酶 体 增 殖 物 激 活 受 体(PPAR)一 抗(Abcam)、GAPDH 一抗(Abcam)、HRP 标记的山羊抗小鼠/兔IgG二抗(雅酶)、蛋白制胶电泳与转膜系统(碧云天)、倒置显微镜(OLYMPUS)、酶标仪(Thermofisher)。1.2.2细胞培养与传代将细胞加入含有10%胎牛血清和1%抗生素的完全培养基,置于T25细胞培养瓶中,在37、5%CO2培养箱中培养。每
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