葛根素抑制自噬改善脂多糖诱导的小鼠肝脏损伤作用研究.pdf
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1、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝病诊治葛根素抑制自噬改善脂多糖诱导的小鼠肝脏损伤作用研究赵裕沛1,朱益敏1,徐小勇1,贺彬婵1,闵海燕1,王嫘2(1.南京中医药大学第二附属医院 南京 210017;2.江苏省中西医结合医院,江苏省中医药研究院 南京 210028)摘要:目的观察葛根素对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠肝脏损伤表型的改善作用,并探讨相关分子机制。方法选取18
2、只C57BL/6J小鼠,随机分为3组:0.9%:NaCl(腹腔注射,20 mgkg-1)处理为对照组(6只)、LPS(腹腔注射,20 mgkg-1)为脓毒血症肝损伤模型组(6只)、及模型基础上予以葛根素(腹腔注射,160 mgkg-1)的干预组(6 只)。24 h 后,检测小鼠血清中的丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)水平,HE染色、免疫组化、免疫荧光检测实时定量PCR(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-P
3、CR)、蛋白质印迹法(Western blot)检测肝脏组织相关基因表达,并用人正常肝细胞株LO2验证。结果与正常对照组比,模型组小鼠的血清ALT 和 AST 水平显著增高,肝脏组织中凋亡相关基因 P53 和分解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(Cleaved Caspase3,cl.Cas3)表达增多,促炎因子白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、干扰素(Interferon-,IFN-)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF-)水平增加,抗炎因子白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)水平降低。p62表达减少,Beclin1、LC
4、3B表达增多。给予模型小鼠葛根素干预后,可有效逆转上述指标变化。体外实验重现上述结果。结论在LPS诱导的肝损模型中,葛根素可通过抑制自噬相关蛋白的过度表达,减少肝细胞死亡,改善小鼠的肝脏损伤病理表型,其机制可能是通过下调 Toll 样受体 4(Toll-like receptor4,TLR4)实现的。提示葛根素早期干预可作为一种治疗肝脏损伤的新方法。关键词:葛根素 脂多糖 小鼠 肝脏损伤 自噬doi:10.11842/wst.20220330009 中图分类号:R285.5 文献标识码:A肝脏是感染早期损伤靶标之一,其功能障碍是多器官功能障碍的关键标志之一,也是重症监护病房患者常见死因1。肝损
5、伤不仅会导致肝功能衰竭,造成急性肝衰竭(Acute liver failure,ALF),还会加重整体病情,影响预后,甚至导致死亡。ALF病程迅速,病死率高,目前临床缺乏有效干预手段。针对早期肝损害的预防或治疗可有效改善预后1-3。葛根始记于 神农本草经:“葛根,消渴,身大热,呕吐,诸痹,起阴气,解诸毒”,是豆科植物野葛(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)的干燥根,味甘辛性凉,归肺胃经,常用于外感热病、麻疹、脾胃系统疾病等,并可用于解酒。葛根素(Puerarin,PUE)是一种来源于中药葛根的异黄酮类单体化合物,因具有多种生物活性,如抑制氧化应激、改善胰岛素水平、减轻炎症
6、反应、抑制细胞凋亡等,常用于多种疾病的治疗,包括糖尿病肾病、心脑血管疾病、骨骼生成异常、老年痴呆及肿瘤4-5。葛根素对慢性代谢性疾病的肝脏损伤表现出一定的保护作用6-7。在急性肝损伤研究中,LPS可引起强烈的免疫反应4-5。LPS诱导的急性肝损伤模型是目前常用的肝脏损伤机制研究模型4-5,8。葛根素可 收稿日期:2022-03-30 修回日期:2022-08-01 国家科学技术部国家重点研发计划专项子课题(2018YFC2002100):老年围术期肠道微生态与预后关联机制研究,负责人:闵海燕。通讯作者:王嫘,博士后,主要研究方向:细胞和分子免疫研究。1851 Modernization of
7、Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 通过降低细胞死亡率,改善肝损表型,但具体分子机制仍未完全阐明9。本研究利用LPS诱导小鼠急性肝损伤模型,在刺激30 min后,采用葛根素干预治疗,评估葛根素对模型小鼠肝脏病理表型的改善作用,并进一步探讨相关分子机制。1 材料和方法 1.1动物分组SPF 雄性 C57BL/6J 小鼠(6 周龄,20-25 g)18 只,购于江苏省集萃药康生物科技股份有限公司。所有购买小鼠在SPF条件下,维持
8、饲养1周后,随机分为对照组(Normal contrast,NC),肝损模型组(LPS)和葛根素干预组(LPS+PUE),每组6只。本研究所涉相关动物实验均按照动物福利进行实验设计,实验过程遵循科技部的 实验动物指南,并严格按照 实验动物护理和使用指南(南京大学,伦理批准文号:IACUC-2003071)进行。小鼠处理参考文献方法8,10,具体如下:肝损模型组小鼠(腹腔注射10 mgkg-1 LPS),葛根素干预组(腹腔注射10 mgkg-1 LPS,30 min后,腹腔注射100 mgkg-1葛根素),正常组(腹腔注射,等体积PBS溶液)。1.2细胞培养和处理人肝细胞系 LO2 购自中国科学
9、院上海细胞所。细胞培养条件为:添加10%(v/v)胎牛血清和1%青霉素链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)培养基,维持37,5%CO2的培养条件,每2天更换1次培养基。待细胞生长至 60%-70%密度时,将 LO2细胞转移至6孔板,进行以下处理:LPS(100 ngmL-1)处理30 min 后,加入浓度葛根素溶液(20 molL-1),处理24 h后,提取细胞蛋白质,进行特定蛋白质表达水平测定。1.3主要试剂脂多糖(美国Sigma公司);葛根素注射液(广州白云山天心制药股份有限公司);丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)ELISA剂盒(上海麦约尔生物技
10、术有限公司);二辛酸(Bicinchonininc acid,BCA)蛋 白 浓 度 测 定 试 剂 盒(美 国 Thermo Scientific 公司);ECL Plus 蛋白质印迹检测试剂、P53抗体、Elite ABC试剂盒、3,3-二氨基联苯胺(DAB)底物、蛋白酶及磷酸酶抑制剂、RIPA 裂解液(美国Millipore公司);DMEM培养基、胎牛血清,青霉素链霉素(美国 Gibco 公司);TLR4 抑制剂 TAK-242(美国Sigma公司);Cleaved Caspase3、Beclin1、p62、LC3、磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate
11、dehydrogenase,GAPDH)、肌纤蛋白(Actin)抗体(美国Cell Signaling Technology 公司);TRIzol 试剂,iScript cDNA合成试剂盒(中国Vazyme公司)。1.4酶联免疫吸附实验(ELISA)测定肝酶活性小鼠处理 24 h 后,异氟烷麻醉,眼球取血后,2000 rmin-1离心 10 min,取上层血清,根据 ELISA 试剂盒说明书的操作说明,检测小鼠血清 ALT 和 AST活性。1.5HE染色、免疫组化、免疫荧光分析小鼠经断颈处死后,取肝脏左叶约2 cm3组织,经4%多聚甲醛溶液固定,剩余肝组织放入-80冰箱保存备用。固定的肝组织经
12、石蜡包埋后切片,经苏木精和伊红染色,光学显微镜下进行肝组织形态学观察。选择P53免疫组化抗体孵育,4过夜,Elite ABC试剂盒和DAB底物进行免疫组织化学染色,光学显微镜下观察P53的表达水平。1.6实时荧光定量PCR使用TRIzol试剂从组织样品分离提取总RNA,逆转录成 cDNA(iScript cDNA 合成试剂盒),使用 SYBR green PCR Master Mix定量检测相应基因的转录水平,所 用 仪 器 为 viia 7 实 时 PCR 系 统(美 国 Applied Biosystems)。应用ct法计算对应比值并统计学分析。样品进行3次重复,每个实验至少进行3次。表1
13、为所用引物的序列信息。1.7蛋白质Western blot检测取20 mg冻存组织,研磨后,加入200 L含有蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液,冰上裂解15 min。4离心机13 300 rmin-1离心20 min,取蛋白上清后,根据BCA蛋白浓度测定试剂盒的操作说明,检测提取的蛋白浓度,加 SDS 蛋白变性缓冲液,100,5 min。取 50 g 变性蛋白,经 10%SDS-PAGE 垂直电泳、转膜、封闭后,与目的蛋白的一抗孵育(4过夜)后,洗脱,与相应二抗孵育(室温1 h),ECL发光显影并定量分析。使用Image J软件(NIH,Bethesda,MD,USA)通过光密度测定法定量
14、条带的强度(相对蛋白水平)。1.8数据分析使用GraphPad软件分析实验数据,数据用均数 1852 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医药与肝病诊治标准误来表示,各组间比较采用完全随机方法分析(One-way ANOVA),P0.05认为差异有统计学意义。2 结果 2.1葛根素显著改善LPS诱导的小鼠肝脏损伤HE检测显示,与对照组相比,LPS(20 mgkg-1)腹腔注射小鼠24 h后,小鼠肝脏组织表现出严重的病
15、理异常(图1A),有肝脏组织结构破坏、肝组织充血、水肿、炎性细胞大量浸润。检测后发现,LPS模型组小鼠血清中ALT和AST的水平显著高于对照组,提示模型组织肝脏受损严重(图1B)。在给予葛根素处理后,上述肝组织病理特征和血清肝损指标,均得到显著改善,提示葛根素显著改善了 LPS 诱导的肝脏组织损伤(图1)。2.2葛根素有效抑制LPS诱导的小鼠肝脏组织炎症水平随后,检测了小鼠肝脏组织中炎症相关指标的转录水平。结果显示,与对照小鼠相比,LPS诱导的肝损模型小鼠的肝脏组织中,促炎因子IL-6、TNF-、IFN-的转录水平显著增加,而抗炎因子IL-10则显著降低,在葛根素干预后,上述炎症因子水平均得到
16、逆转,提示葛根素能有效地抑制炎症因子的产生(图2)。2.3葛根素抑制小鼠肝脏组织中LPS刺激引起的细胞凋亡为了探索葛根素改善肝脏损伤的机制,首先对不同处理组小鼠肝脏组织进行细胞死亡相关分子的表达水平检测。比较发现,与正常对照组相比,LPS模型小鼠的肝组织内,细胞凋亡相关因子P53表达显著增强(图 3A),且 凋 亡 指 示 蛋 白 cleaved-caspase3(cl.Cas3)蛋白表达水平也显著增加,提示LPS刺激肝脏细胞的凋亡产生。而葛根素干预后,模型小鼠肝脏中的P53 和 cl.Cas3 的水平显著降低,提示葛根素抑制了LPS 刺激的肝脏凋亡(图 3B)。上述实验结果提示,LPS诱导肝
17、脏细胞的过度凋亡参与肝损发生发展,葛表1实时荧光定量PCR引物GeneActinIL-10TNF-IFNIL-6LC3Bp62Beclin1Forward primers(5-3)GGACGTACAACTGGTATTGTGCAGCCTTATCGGAAATGATCCAGTCAGGCGGTGCCTATGTCTCATGAACGCTACACACTGCATCTAGTCCTTCCTACCCCAATTTCCTTATAGAGCGATACAAGGGGGAGAGGATGGGGACTTGGTTGCCCAGAGAAGAATGCTGTACGAATReverse primers(5-3)TCGGCAGTAGTCACGAA
18、GGAGGCCTTGTAGACACCTTGGTCGATCACCCCGAAGTTCAGTAGCCATCCTTTTGCCAGTTCCTCTTGGTCCTTAGCCACTCCTTCCGCCGTCTGATTATCTTGATGAGTCACAGATCACATTGGGGTGCTCCATCGAGTCTTATCCTCCAC图1葛根素改善LPS诱导的小鼠肝脏损伤注:A:小鼠肝脏组织HE染色;B:小鼠血清中ALT和AST的水平;与NC组相比,*P0.01;与LPS组相比,#P0.05。1853 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Med
19、ica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 图2葛根素改善小鼠肝脏炎症状态注:与NC组相比,*P0.05,*P0.01,*P0.001;与LPS组相比,#P0.05。图3葛根素抑制小鼠肝脏组织中LPS刺激引起的细胞死亡注:A:免疫组化显示小鼠肝脏组织P53表达;B:免疫荧光显示小鼠肝脏组织cl.Cas3表达水平。1854 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术
20、-中医药现代化中医药与肝病诊治根素干预处理可通过显著降低凋亡相关蛋白的表达水平,抑制肝脏的细胞凋亡。这提示葛根素具有良好的护肝作用。2.4葛根素抑制 LPS 诱导的肝脏组织中自噬过度激活有研究发现,葛根素可通过激活PI3K/Akt信号通路,减少肝细胞死亡来治疗小鼠的急性肝衰竭11,也有研究发现自噬可通过调控炎症相关因子在LPS诱导的急性肺损伤小鼠模型发挥作用12。在本实验中,本课题组检测了小鼠肝脏组织中自噬相关因子 p62,Beclin1和LC3B的mRNA表达水平。结果显示在LPS处理组中,LC3和Beclin1表达显著增加,而自噬抑制指标p62则明显降低,提示LPS处理后的24 h内,肝脏
21、组织自噬水平显著增强,可能是造成肝脏细胞死亡的原因之一。在此基础上,给予葛根素处理,可明显抑制肝组织中 Beclin1 和 LC3 的表达,增加 p62 的表达(图 4A)。与 mRNA 一 致,蛋 白 质 水 平 检 测 显 示(图4B),LPS处理24 h后,模型组小鼠肝脏自噬水平增加,表现为Beclin1和LC3蛋白水平显着增高,而p62蛋白表达则明显降低。这表明葛根素可有效地抑制LPS诱导的肝细胞自噬。2.5葛根素可能通过下调TLR4抑制肝脏过度自噬最后,利用体外培养的正常人肝细胞系LO2细胞验 证 体 内 实 验 结 果。本 课 题 组 发 现,体 外 LPS(100 ngmL-1
22、4 h后,肝细胞中 TLR4的表达水平显著增加,提示炎症激活,同时观察到自噬降解相关p62的蛋白表达水平急剧下降,LC3B的表达水平显著增强,提示 LPS 刺激 24 h 后自噬水平显著增加。葛根素(20 molL-1)处理后,自噬相关蛋白 LC3B的表达显著降低,而自噬降解蛋白p62的水平显著增加,这与已知TLR4抑制剂TAK-242处理后的效果一致,提示葛根素的作用效果和TLR4抑制剂类似,可以抑制LPS诱导的肝细胞自噬(图5)。3 讨论与结论 3.1早期使用葛根素可治疗LPS诱导的肝脏损伤自噬在肝稳态中发挥重要作用。有研究发现,自噬在LPS诱导的肝损伤中被过度激活13。最近的报道表明,自
23、噬可以在肝脏损伤中充当保护者或杀手,这图4葛根素抑制LPS诱导的肝脏组织中自噬蛋白过度激活注:A:qPCR分析肝脏组织中自噬相关基因的转录水平;B:Western blot检测肝脏组织中自噬相关蛋白的表达水平;与NC组相比,*P0.01;与LPS组相比,#P0.01,#P0.001。图5葛根素抑制LPS刺激后自噬可能通过下调TLR41855 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 取决于疾病所处
24、的阶段。在起始阶段,自噬可能对肝损伤有益,有研究已经确定了这种观点14,即细胞自噬在脓毒症肝损伤过程中起着重要的保护作用,可通过改善微循环障碍、清除受损线粒体以及炎症因子来降低肝损程度。然而,随着疾病进展,当肝脏损伤恶化时,自噬过多可能反而加重肝坏死15。本课题组研究发现,LPS(20 mgkg-1)刺激24 h后,小鼠肝脏表现出严重的组织受损,肝组织细胞凋亡增加,伴随自噬相关蛋白被激活,在 LPS处理 30 min后,进行葛根素干预,可通过抑制肝细胞的过度自噬,从而有效抑制细胞凋亡,达到治疗的效果。本课题组发现,体外LPS刺激后肝细胞中 TLR4的表达水平显著增加,提示炎症激活,同时观察到自
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