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1、曹鲁娜,周春峰,魏红焕,等.葛根汤颗粒微生物限度检查方法的适用性试验研究J.中兽医医药杂志,2023,42(5):71-74葛根汤颗粒来源于汉代著名医学家张仲景所著伤寒论 中所载葛根汤,为便于服用,改良为颗粒剂型。现收载于 中华人民共和国药典(简称 中国药典)2020年版一部,由葛根、麻黄、白芍等7味药经现代工艺加工制成,具有发汗解表、升津舒经之功效,用于风寒感冒。标准制法中取葛根、麻黄加水温浸30 min,与白芍等其余五味药加水煎煮制成浸膏后,加适量辅料制成颗粒剂终产品1。葛根汤对金黄色葡萄球菌等有抑菌作用,葛根汤颗粒中葛根、麻黄、白芍等药味均有不同程度的抑菌作用2-7。原料的抑菌活性可能会
2、影响终产品的微生物限度检查结果,对有抑菌活性的样品,应建立适宜的方法去除或灭活其抑菌活性,保证方法的可靠性和适用性,真实反映出样品的实际微生物污染程度。本研究采用3批样品开展方法适用性试验,建立葛根汤颗粒的微生物限度检查方法。1仪器与材料1.1仪器设备高压蒸汽灭菌器(松下健康医疗器械株式会社);生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司);电热恒温培养箱(上海新苗医疗器械制造有限公司);电子天平(上海浦春计量仪器有限公司);精密恒温培养箱(上DOI:10.13823/ki.jtcvm.2023.088中图分类号:S853.7文献标识码:A文章编号:1000-6354(2023)05-0071-04葛
3、根汤颗粒微生物限度检查方法的适用性试验研究曹鲁娜1,周春峰1,魏红焕2,赵蕊蕊1(1.山东省菏泽市食品药品检验检测研究院,山东菏泽274032;2.山东省鄄城县什集镇卫生院,山东鄄城274606)摘要:建立葛根汤颗粒的微生物限度检查方法。按照 中华人民共和国药典 2020年版四部通则,采用平皿倾注法(1 10)和增加稀释液体积法对药典规定的5种试验菌株进行微生物计数方法回收试验,计算回收比值。采用常规培养基体积和增加培养基体积对控制菌检查中的大肠埃希菌检查进行方法适用性试验,通过增菌、选择和分离培养等试验,考察方法适用性。结果显示,采用平皿倾注法(1 10)时,霉菌和酵母菌总数计数中白色念珠菌
4、和黑曲霉回收比值均在0.52.0范围内;需氧菌总数计数中铜绿假单孢菌和枯草芽孢杆菌回收比值小于0.5。采用平皿倾注法(1 50)时,需氧菌总数计数5种规定试验菌株的回收比值均在0.52.0范围内;采用常规培养基体积直接接种法检查大肠埃希菌,阳性对照组检出试验菌,阴性对照组和供试品组均未检出试验菌。可采用平皿倾注法(1 50)计数葛根汤颗粒需氧菌总数,可采用平皿倾注法(1 10)计数霉菌和酵母菌总数,可采用常规培养基体积检查大肠埃希菌。本研究建立的葛根汤颗粒微生物限度检查方法有效可行。关键词:葛根汤颗粒;微生物限度;平皿倾注法;增加稀释液体积;方法适用性试验收稿日期:2023-05-24;网络首
5、发日期:2023-06-25网络首发链接:https:/ of chlortetracycline premix was stable for determining within 6 hours.The method and antibiotic microbiologicalassay were used to determine the content of chlortetracycline premix randomly selected,and the results were consistent.Thismethod has good precision,specificity
6、 and durability.This method is easy to operate,accurate in quantification,and canquickly produce detection results.It can be used to determine the content of chlortetracycline in chlortetracycline premix.Keywords:chlortetracycline premix;content determination;HPLC 71Journal of Traditional Chinese Ve
7、terinary Medicine2023年42卷第5期Vol.42 No.5 2023海一恒科学仪器有限公司);浊度计(上海昕瑞仪器仪表有限公司)。1.2供试品与试剂供试品:葛根汤颗粒,批号分别为 21040421、22121821、22122221。稀释液:pH值7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液,购自北京陆桥技术股份有限公司。聚山梨酯80,购自国药集团化学试剂有限公司。1.3试验用菌株试验用菌株均符合 中国药典 2020年版四部8要求,购自中国食品药品检定研究院,经实验室复苏、复活、传代并鉴定合格,均为第4代菌株。1.4培养基胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA,批号 210602),胰酪大豆胨液体培养
8、基(TSB,批号 220519),沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA,批号220426),麦康凯液体培养基(MacB,批号 211214),麦康凯琼脂培养基(MacA,批号 220505),均购自北京陆桥技术股份有限公司,经过适用性检查,符合 中国药典 2020 年版四部8规定。2方法与结果2.1试验菌液制备取“1.3”项下试验用菌株,按照 中国药典 2020年版四部8要求,分别制备用于微生物计数的菌悬液或孢子悬液(菌落数为1 00010 000 cfu/mL)、用于控制菌检查的菌悬液(菌落数不大于100 cfu/mL)。2.2供试液制备随机取“1.2”项下 4 个最小包装的供试品,按照中国药典 2
9、020 年版四部8要求,依法制成 1 10、1 20、1 50、1 80的系列稀释倍数供试液9,分别标记为供试液、供试液、供试液、供试液。2.3计算与结果判断按照 中国药典 2020年版四部8规定,计算回收比值并进行结果判断。2.4微生物计数方法适用性试验2.4.1平皿倾注法(1 10)试验组(A组):无菌试管加入9.9 mL“2.2”项下供试液,加入“2.1”项下用于微生物计数的 5 种试验菌液或孢子悬液 0.1 mL,混匀,备用。供试品对照组(B组):以“1.2”项下稀释液代替试验菌液或孢子悬液,同A组操作。菌液对照组(C组):以“1.2”项下稀释液代替供试液,同A组操作。阴性对照组(D组
10、):取“1.2”项下稀释液。A、B、C、D组各取1 mL注入一次性无菌平皿(直径90 mm),平行制备2份。按照 中国药典 2020年版四部8培养要求注入温度不高于 45的 SDA 或 TSA 培养基,测定各平皿菌落数,计算各试验菌回收比值,结果详见表 1。如果阴性对照组有菌落生长,提示本次试验失败,需分析原因并采取纠正措施后重新开展试验。采用平皿倾注法(1 10)时,需氧菌总数中铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌受到抑制,回收比值小于0.5,可能与葛根中所含葛根素、白芍中所含芍药苷、桂枝中所含桂皮醛等有关,尤其是芍药苷和桂皮醛具有广谱抗菌作用10-12,须采取适宜方法消除其抑菌活性;霉菌和酵母菌总数
11、中白色念珠菌和黑曲霉回收比值均在0.52.0范围内,方法可行。2.4.2预试验(增加稀释倍数)取“2.2”项下供试液、供试液、供试液以及“2.1”项下铜绿假单胞菌和枯草芽孢杆菌试验菌液,同“2.4.1”平皿倾注法(1 10)操作。结果详见表2。由表2可见,采用平皿倾注法(1 50、1 80)时,两种敏感菌株回收比值均在0.52.0范围内,无明显差异。若方法适用性试验符合要求,应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检查8,故葛根汤颗粒需氧菌总数计数可选用平皿倾注法(1 50)。2.4.3平皿倾注法(1 50)取“2.2”项下供试液,同“2.4.1”平皿倾注法(1 10)操作,结果详见
12、表3。由表1、表2、表3试验结果可知,采用平皿倾注法(1 50)计数需氧菌总数、采用平皿倾注法(1 10)计数霉菌和酵母菌总数时,各试验菌株回收比值均在0.52.0范围内,符合 中国药典 2020年版四部8要求,可用于葛根汤颗粒的微生物限度检查。表1平皿倾注法(1 10)微生物计数方法适用性试验回收比值Table 1Recovery ratio in applicability test of microbialcounting method by pouring plate(1 10)样品批号210404212212182122122221需氧菌总数金黄色葡萄球菌0.720.810.68铜绿
13、假单胞菌0.420.390.45枯草芽孢杆菌0.440.400.47白色念珠菌0.960.840.92黑曲霉菌1.050.971.01霉菌和酵母菌总数白色念珠菌0.950.860.93黑曲霉菌1.161.060.99 72曹鲁娜,周春峰,魏红焕,等.葛根汤颗粒微生物限度检查方法的适用性试验研究J.中兽医医药杂志,2023,42(5):71-742.5控制菌检查研究表明,葛根汤颗粒处方中的葛根、白芍对大肠埃希菌有抑菌活性,在考察大肠埃希菌检查方法适用性试验时,使用常规培养基体积和增加培养基体积平行试验。按照 中国药典 2020年版四部8规定,分别制备阳性对照组、供试品组和阴性对照组,分别加入TS
14、B 100 mL、200 mL、300 mL,混匀,33增菌培养24 h。取1 mL培养物,加入100 mL MacB,43选择培养 48 h。挑取培养物划线接种至 MacA,33分离培养 72 h。试验结果见表 4。由表 4 可知,在 100 mL、200 mL、300 mL TSB中阳性对照组均检出试验菌,供试品组和阴性对照组均未检出试验菌,方法有效、可行,应选用常规培养基体积100 mL。3讨论药品微生物限度检查是控制药品质量、保障药品安全的一项重要措施。中药的抑菌活性来源复杂,一是处方药材中抑菌活性成分,二是处方药材的产地、采收季节、炮制工艺等,三是中药的加工提取过程中处方药味相互作用
15、可能产生抑菌活性物质,四是中药现代制备工艺中辅料、防腐剂、赋形剂等可能引入抑菌活性。微生物限度检查能客观反映企业在原料采购、生产加工、仓储运输等环节的整体质量控制水平,应建立有效的检验方法,确保检验数据的科学性和准确性。2010年版以前 中国药典 对方法适用性试验未作要求,试验中常见低稀释级样品无菌落生长而高稀释级样品却有菌落生长的现象,药品中含有抑菌活性成分是产生异常结果的主要原因。方法适用性试验本质是建立的微生物限度检查方法对样品影响小、操作效率高,重点和难点是去除样品抑菌活性。相对于薄膜过滤法、使用中和剂或灭活剂等方法,增加稀释倍数方法具有操作简单、迅速、对样品影响小等优点,去除样品抑菌
16、活性时常作为首选方法。在葛根汤颗粒需氧菌总数计数方法适用性试验中,采用平皿倾注法(1 10)时,试验结果提示样品对铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌具有抑菌活性。通过平皿倾注法(1 10)选择敏感菌株,可防止假阳性或假阴性结果出现,保证方法的有效性。4结论在葛根汤颗粒的微生物限度检查中,可采用平皿倾注法(1 50)计数需氧菌总数,采用平皿倾注法(1 10)计数霉菌和酵母菌总数,采用常规体积直接接种法检查大肠埃希菌。本研究建立的方法可以监测葛根汤颗粒的微生物真实污染情况,有效控制药品的安全性。参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部 S.北京:中国医药科技出版社,2020:1711-1722表
17、2需氧菌总数敏感菌株(预试验)方法适用性回收比值Table 2Recovery ratio in aerobic count sensitive strains(preliminary test)method applicability计数方法平皿倾注法(1 20)平皿倾注法(1 50)平皿倾注法(1 80)铜绿假单胞菌210404210.810.970.95221218210.740.890.93221222210.750.950.98枯草芽孢杆菌210404210.440.690.72221218210.480.760.85221222210.410.730.77表4大肠埃希菌检查方法适用
18、性试验结果Table 4Applicability results of Escherichia coli test样品批号210404212212182122122221TSB体积/mL阳性对照组100+200+300+供试品组100-200-300-阴性对照组100-200-300-“+”表示检出试验菌,“-”表示未检出试验菌“+”indicated that the test bacteria were detected,“-”indicatedthat no test bacteria were detected表3平皿倾注法(1 50)计数需氧菌总数方法适用性回收比值Table 3R
19、ecovery ratio in total aerobic bacteria plate pour(1 50)method applicability样品批号210404212212182122122221需氧菌总数金黄色葡萄球菌0.720.810.68铜绿假单胞菌0.420.390.45枯草芽孢杆菌0.440.400.47白色念珠菌0.960.840.92黑曲霉菌1.050.971.01 73Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine2023年42卷第5期Vol.42 No.5 20232周昕伤寒论 含芍药方剂30首对8种细菌的抑菌
20、作用 J.中外妇儿健康,2011,19(8):317-3183唐婷范,黄芳丽,朱家庆,等.超声波辅助提取葛根异黄酮的工艺优化及其抑菌活性研究 J.食品研究与开发,2020,41(12):30-364许会艳,徐攀攀,李浩龙,等.4种中药水提物对枯草芽孢杆菌活性的影响 J.现代畜牧兽医,2021(8):1-45刘小凤,刘东玲,侯雯倩,等.药食同源中药联合抑菌作用及抑菌喷雾剂的研制 J.中兽医医药杂志,2023,42(2):15-206贾泽,王春光,张石磊,等.赤芍水提物及芍药苷对大肠埃希菌抗菌增敏活性的影响 J.中国兽医学报,2019,39(10):2026-20327韩维维,方东军,李陆军,等.
21、甘草化学成分及生物活性研究进展 J.化学工程师,2022,36(2):56-58+678国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部 S.北京:中国医药科技出版社,2020:160-1719中国食品药品检定研究院.中国药品检验标准操作规范 M.北京:中国医药科技出版社,2019:44710赵丽平,张雯雯,汪金萍,等.葛根素的提取及生物活性分析 J.食品研究与开发,2022,43(17):107-11211方芳,张恒,贾建波,等.7 种美容中药水煎液的抑菌作用 J.江苏农业科学,2013,41(2):265-26812韦露玲,张淼,黄飘玲,等.桂枝抗菌活性成分及其作用机制研究进展 J.湖北农业科学,
22、2021,60(21):21-25Applicability test of microbial limit test for Gegentang granulesCAO Luna1,ZHOU Chunfeng1,WEI Honghuan2,ZHAO Ruirui1(1.Heze Institute for Food and Drug Control in Shandong Province,Heze Shandong 274032,China;2.Shiji Town HealthCenter of Juancheng County,Shandong Province,Juancheng S
23、handong 274606,China)Abstract:To establish a method for microbial limit test of Gegentang granules.According to the four general rules ofChinese Pharmacopoeia(2020 edition),the recovery test of five test strains was carried out by using the plate pouringmethod(1 10)and increasing the volume of dilue
24、nt,then the recovery ratio was calculated.Routine medium volumeand increasing medium volume were used to test the applicability of the method for Escherichia coli in the controlbacteria test,and the applicability of the method was investigated by enrichment,selection and isolation culture tests.The
25、results showed that the recovery ratio of Candida albicans and Aspergillus niger in the total count of mold and yeastwas in the range of 0.5-2.0 by the plate pouring method(1 10);the recovery ratio of Pseudomonas aeruginosa andBacillus subtilis in total aerobic count was less than 0.5.When the plate
26、 pouring method(1 50)was used,the recoveryratio of aerobic bacterial count of the five specified test strains was in the range of 0.5-2.0.Escherichia coli was detectedby direct inoculation method of conventional culture medium volume.Test bacteria were detected in the positive controlgroup,but not i
27、n the negative control group and test sample group.The total number of aerobic bacteria in Gegentanggranules can be determined by plate pouring method(1 50),the total number of mold and yeast can be determined byplate pouring method(1 10),and Escherichia coli can be detected by conventional medium volume.The microbial limittest method of Gegentang granules established in this study is effective and feasible.Keywords:Gegentang granules;microbial limit;plate pouring method;increasing the diluent volume;method applicability 74