根系分泌物对生物强化修复PAHs污染土壤的影响.pdf
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1、中国环境科学 2023,43(8):41834193 China Environmental Science 李瑜婷,鲍文秀,张 闻,等.根系分泌物对生物强化修复 PAHs 污染土壤的影响 J.中国环境科学,2023,43(8):4183-4193.Li Y T,Bao W X,Zhang W,et al.Effects of root exudates on bioaugmentation of PAHs-contaminated soil J.China Environmental Sicence,2023,43(8):4183-4193.根系分泌物对生物强化修复 PAHs 污染土壤的影响
2、 李瑜婷,鲍文秀,张 闻*,王加宁,黄玉杰,宋繁永(齐鲁工业大学(山东省科学院),山东省科学院生态研究所,山东省应用微生物重点实验室,山东 济南 250103)摘要:通过土壤微宇宙实验,探究了生物强化对多环芳烃(PAHs)污染土壤的修复效果及根系分泌物对生物强化修复的影响.结果表明,向土壤中接种PAHs 降解菌群(布鲁氏菌(Brucella sp.)、苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)、鞘脂单胞菌(Sphingomonas sp.)、克雷伯氏菌(Klebsiella sp.)和不动杆菌(Acinetobacter sp.)21d 后,PAHs 残留量较对照下降了 15.8%;在此基础
3、上添加黑麦草实际或模拟根系分泌物均显著增强了生物强化修复效果,PAHs 残留量较对照分别下降了 26.3%和 24.6%.3种生物强化措施均改变了细菌群落结构,其中添加根系分泌物后的处理细菌群落结构的改变更大,芳烃降解基因丰度增加得更多,显示根系分泌物通过促进 PAHs 降解菌的生长影响细菌群落从而提升生物强化修复效果.两类根系分泌物对细菌群落影响的差别未引发其对生物强化促进效果的差异.该研究可为优化有机污染土壤生物强化修复技术提供参考.关键词:多环芳烃;土壤修复;黑麦草;根系分泌物;生物强化 中图分类号:X53 文献标识码:A 文章编号:1000-6923(2023)08-4183-11 E
4、ffects of root exudates on bioaugmentation of PAHs-contaminated soil.LI Yu-ting,BAO Wen-xiu,ZHANG Wen*,WANG Jia-ning,HUANG Yu-jie,SONG Fan-yong(Shandong Provincial Key Laboratory of Applied Microbiology,Ecology Institute of Shandong Academy of Sciences,Qilu University of Technology(Shandong Academy
5、of Sciences),Jinan 250103,China).China Environmental Sicence,2023,43(8):41834193 Abstract:A soil microcosm experiment was conducted to investigate the effect of bioaugmentation on polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs)-contaminated soil and the influence of root exudates on bioaugmentation.The conte
6、nt of PAHs residue was decreased by 15.8%with PAHs-degrading bacteria(Brucella,Ochrobactrum,Sphingomonas,Klebsiella and Acinetobacter sp.)compared to CK in 21d.The addition of ryegrass or artificial root exudates significantly enhanced the bioaugmentation effect and the contents were decreased by 26
7、.3%and 24.6%compared to CK,respectively.These 3bioaugmentation treatments altered the soil bacterial community structures.Compared with the inoculation of PAHs-degrading bacteria alone,the addition of root exudates changed the community structure more significantly and increased the abundance of aro
8、matic compounds degradation-related genes more markedly,indicating that the root exudates affected the bacterial community by promoting the growth of PAHs-degrading bacteria and thus enhanced the bioremediation effect.The different effects of the two types of root exudates on soil bacterial communit
9、y did not lead to a difference in their contribution to the promotion for bioaugmentation.This study can provide a reference for optimizing bioaugmentation remediation techniques for organic-contaminated soils.Key words:Polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs);soil remediation;ryegrass;root exudates;b
10、ioaugmentation 多环芳烃(PAHs)是一类具有致癌性、致畸性、致突变性以及环境持久性等特点的有机污染物1-2,稳定的化学性质和疏水特性使其易于积累于土壤环境中,影响土壤的生态功能和农作物的生产质量,并可能进入食物链对人类健康造成风险3.在 PAHs污染土壤诸多修复技术中,生物修复因环境友好、成本较低等优点受到了广泛关注4.植物-微生物联合修复是结合了植物根际修复和专性降解菌生物强化优势的一种生物修复方法,主要利用植物根系分泌物对降解微生物的降解强化作用,加速土壤 PAHs的污染修复进程5-6.根际土壤中植物的根系分泌物可通过提供丰富的营养或共代谢底物,提高土壤微生物的数量和活性,
11、促进 PAHs 的微生物降解7-8.土壤中的微生物群落是影响 PAHs 生物修复效果的关键因素,群落优势物种组成、多样性及结构的变化会引发土壤生态系统中微生物群落功能和代谢的变化,进而影响 PAHs 的去除9-11.不同植物的根系分泌物组分具有特异性,且植 收稿日期:2023-04-25 基金项目:国家重点研发计划项目(2019YFC1804103);山东省自然科学基金资助项目(ZR2022MD116)*责任作者,副研究员,zw- 4184 中 国 环 境 科 学 43 卷 物受生长周期、温度、土壤性质等因素影响,根系分泌物组分及分泌量会发生变化,作用范围随着离根系距离的增加而递减,使得根际效
12、应具有复杂性,不易直接评估根系分泌物的作用.为厘清根系分泌物在植物-微生物联合修复中的作用机制,有学者通过种植植物获取确定组分和浓度的根系分泌物后,与外源专性降解菌同时直接投加至土壤,研究其对 PAHs 污染土壤微生物的影响,对 PAHs 去除效率的提高提出了多种作用机制,认为细菌群落结构的改变12及外源菌降解活性的增强5可促进 PAHs 的降解.目前相关研究较为有限,投加的降解菌多为单一PAHs 降解菌株,但实际污染场地生物强化修复一般使用具有协同作用的降解菌群.外源菌群进入污染土壤后会与土著菌群竞争生长.课题组前期研究了根系分泌物对于芘污染土壤中土著细菌群落的影响,发现其对细菌群落的丰富度
13、和多样性影响不大,但对群落结构的影响较为显著,促进了土著PAHs 降解菌的生长及部分功能基因丰度的增加.当外源菌群与土著菌群竞争共存时,根系分泌物对整体土壤微生物群落产生怎样的影响,鲜有报道,有必要明确.假设外源菌群进入污染土壤后与土著菌群共存,共同发挥 PAHs 降解作用;添加根系分泌物可能会影响整体土壤细菌群落的结构和功能,进而影响其降解作用的发挥.基于此,本文选用课题组前期筛选获得的 PAHs 高效降解菌群,对 PAHs 污染土壤进行生物强化修复,同时投加黑麦草实际根系分泌物,研究根系分泌物对生物强化效果及土壤细菌群落结构及功能的影响;配制相同浓度、配方明确的模拟根系分泌物与实际根系分泌
14、物进行对比研究,探讨两类根系分泌物作用的异同,考察模拟根系分泌物在土壤修复工程中辅助应用的可行性.研究结果可为明确根系分泌物在植物-微生物联合修复 PAHs污染土壤的作用机制、优化 PAHs 污染土壤生物修复技术提供参考.1 材料与方法 1.1 PAHs 和植物 根据 PAHs 污染土壤相关研究13-15,土壤中PAHs 以三、四及五环芳烃居多,本文选取三环芳烃菲(PHE)、四环芳烃芘(PYR)和五环芳烃苯并a芘(BAP)为代表性 PAHs 进行研究,纯度分别大于98.0%、98.0%和 96.0%.供试植物为常用于 PAHs 污染土壤修复的多年生黑麦草(Lolium perenne L.).
15、1.2 土壤 实验土壤采自山东省济南市(36.71N,117.07E),土地类型为棕壤,其基本理化性质如下:pH=8.25,有机质含量为 52.1g/kg,全氮、全磷及全钾含量分别为2.28,0.96和13.0g/kg,阳 离 子 交 换 量 为22.6cmol/kg.根据文献报道土壤中 PAHs 污染水平、种类及占比16-17,设置土壤中总PAHs初始污染水平为 40mg/kg,其中 PHE:PYR:BAP 质量比为 2:2:1.称取适量土壤,加入 PAHs-丙酮储备液,搅拌均匀,置于通风橱中挥发丙酮,之后用于实验.1.3 根系分泌物 选取黑麦草根系分泌物和模拟根系分泌物进行对比研究.黑麦草
16、根系分泌物通过水培法获取,具体操作参照先前研究18-19并稍作修改.将黑麦草种子置于3%H2O2溶液中消毒20min,使用无菌水冲洗3次,并在无菌水中浸泡过夜.称取40g浸泡过的种子,平铺于育种盘,加入 1L 超纯水,置于培养箱中培养(光暗比,16h:8h;温度,25:20).种子萌发 3d 后,将超纯水置换为 1L 的半量霍格兰氏(Hoaglands)营养液,置于培养箱中继续培养 15d,每 5d 更换一次营养液.之后取出整板黑麦草,使用超纯水冲洗根部,将原育种盘更换为玻璃盘以避免根系分泌物的吸附损失,加入1L超纯水,在培养箱中避光收集根系分泌物24h.玻璃盘中溶液过 0.45m 水系滤膜即
17、获得黑麦草根系分泌物.通过冷冻干燥机进行低温干燥,获得根系分泌物固体,置于 4冰箱储存备用.模拟根系分泌物依据文献配制20-21,包含实际植物根系分泌物中常见的含碳化合物,具体组分为:葡萄糖、果糖和蔗糖,各 50mmol/L;琥珀酸和苹果酸,各 25mmol/L;丝氨酸、精氨酸和半胱氨酸,各12.5mmol/L.1.4 PAHs 降解菌群 课题组前期保藏了 5 株 PAHs 高效降解菌株,分别 为 布 鲁 氏 菌(Brucella sp.)、苍 白 杆 菌(Ochrobactrum sp.)、鞘脂单胞菌(Sphingomonas sp.)、克 雷 伯 氏 菌(Klebsiella sp.)和
18、不 动 杆 菌(Acinetobacter sp.),均 属 于 变 形 杆 菌 门(Proteobacteria).其配伍菌群在 7d 内的 PAHs 降解率可达 24.3%,其中对 PHE、PYR 和 BAP 的降解率分8 期 李瑜婷等:根系分泌物对生物强化修复 PAHs 污染土壤的影响 4185 别为 23.3%,26.4%和 19.6%(50mg/L 的 PAHs-无机盐液体培养基,PHE:PYR:BAP=10:10:1)22.本研究以此菌群对 PAHs 污染土壤进行生物强化修复.各单菌菌株分别在牛肉膏蛋白胨固体培养基(LB 干粉 20.0g,琼脂 20.0g,1L 去离子水,121高
19、压灭菌 20min)上划线活化,于生化培养箱中 30培养72h.分别挑取单菌落至扩大培养基(营养肉汤 18.0g,1L 去离子水,121高压灭菌 20min)中,于摇床中30、150r/min 培养 24h.菌液在 4、8000r/min 下离心 5min,弃去上清液,加入 PBS 溶液重悬(NaCl 8.0081g,KCl 0.2734g,Na2HPO4 1.1502g,KH2PO4 0.2394g,无菌水定容至 1L,pH=7.0,121高压灭菌 20min),制得菌悬液备用.使用稀释平板计数法测得每mL菌悬液的活菌数为1.551010个菌落形成单位(CFU).1.5 土壤修复实验设计 分
20、别称取 15g 土壤于多个棕色玻璃瓶中,进行如下处理:(1)自然衰减处理,命名为 CK,作为对照组;(2)生物强化处理,接种 PAHs 降解菌群,命名为 MC;(3)生物强化+实际根系分泌物处理,接种PAHs降解菌群并添加黑麦草根系分泌物,命名为 MRE;(4)生物强化+模拟根系分泌物处理,接种PAHs降解菌群并添加模拟根系分泌物,命名为 MARE.以上处理中所涉及的PAHs 降解菌悬液投加体积均为 2mL,根系分泌物及模拟根系分泌物浓度均为120mg C/kg.各处理组均设置 3 平行.调整每个瓶中土壤含水率为最大田间持水量的60%,封瓶膜封口后置于光照培养箱中25培养21d,每 7d 采用
21、称重法补水.分别在 0、14d 和 21d 取土样,测定PAHs的残留量;对第21d土样,同时提取土壤 DNA 进行 16S rDNA 扩增子测序.1.6 土壤中 PAHs 的测定 称取 2g 土壤于棕色玻璃瓶中,加入 10mL 二氯甲烷,涡旋 3min 后,超声萃取 10min(功率 500w),3000r/min 离心 10min,获得上层有机相.重复萃取 3次,合并有机相,加入无水 Na2SO4脱水,旋蒸至近干,用甲醇定容至 4mL.通过 0.45m 尼龙滤膜后,使用1260HPLC(Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)测定 PAHs 浓度.色谱柱
22、为安捷伦 Infinity Lab Poro shell 120EC-C18(4.6mm100mm,2.7m),柱温 25.流动相为甲醇和水(9:1),流速 1.0mL/min,进样量为 50L,检测时长为 8.0min.采用 DAD 检测器,PHE、PYR 和 BAP 的检测波长分别为 251nm、240nm 和 296nm.1.7 土壤 DNA 的提取及 16S rDNA 扩增子测序 采用 CTAB 法23从土壤样本中提取基因组DNA,对16S rDNA的V3V4区进行PCR扩增.扩增引 物 为 341F(5-CCTAYGGGRBGCASCAG-3)和806R(5-GGACTACNNGGG
23、TATCTAAT-3).PCR 产物经电泳检测后,对目的条带进行回收和文库构建.通过 Novogene(中国北京)的 Illumina NovaSeq 测序平台进行测序.针对测序得到的双端 reads,进行拼接、过滤和降噪,可对得到的有效数据 ASVs(Amplicon Sequence Variants,即扩增子序列变异)进行后续分析.使用 QIIME2 软件中的 classify-sklearn模块比对得到每个 ASV 的物种信息,计算 goods_ coverage、observed_features、chao1、pielou_e 和shannon 等 Alpha 多样性指数、加权和非加
24、权 unifrac 距离和 Bray-Curtis 距离.通过基于加权unifrac 距离的主坐标分析(PCoA)和无度量多维标定法(NMDS)探究各组间Beta多样性的差异.采用基于线性判别分析(LDA)效应量的分析方法(LEfSe),寻 找 组 间 具 有 统 计 学 差 异 的 细 菌 物 种.使 用PICRUSt2 软件对样本中的微生物群落进行功能预测分析.基于京都基因和基因组百科全书(KEGG)数据库和BioCyc子数据(MetaCyc)进行细菌功能注释,生成了包含 KEGG 直系同源物(KO)和 MetaCyc Pathways(PWY)的绝对丰度和相对丰度的预测表.采用基于 Br
25、ay-Curtis 距离的主成分分析(PCA)探究不同样本中功能基因家族预测组成的差异.1.8 数据统计分析 以土壤中 PHE、PYR、BAP 以及三者之和(总PAHs)的残留含量作为生物强化修复的评价指标,各处理组中PAHs残留量以三平行的平均值来表示.各组之间的数据差异采用 ANOVA 分析进行比较(SPSS 21.0 软件).事先进行方差齐性检验,方差相等时采用 LSD 法,方差不相等时采用 Tamhanes T2 法.使用 Origin 2022b 软件绘图.2 结果与分析 2.1 PAHs 污染土壤的生物强化修复效果 各处理组土壤中 PAHs 的残留量见图 1.修复21d 后,CK、
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