辐射诱变筛选高生长速率的渐狭蜡蚧菌及其生物学特性研究.pdf
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1、激光生物学报ACTALASERBIOLOGYSINICAVol.32 No.5Oct.2023第 32 卷第 5 期2023 年 10 月收稿日期:2023-05-04;修回日期:2023-09-01。基金项目:国家重点研发计划项目(2021YFE0111200-2);湖南省农业科技创新项目(2022CX119)。作者简介:段珂屹,硕士研究生。*通信作者:刘素纯,教授,主要从事微生物发酵及安全控制的研究,E-mail:;王克勤,研究员,主要从事生物资源高效利用及生物炼制技术的研究,E-mail:。辐射诱变筛选高生长速率的渐狭蜡蚧菌及其 生物学特性研究段珂屹1,刘安2,陈亮2,武小芬2,齐慧2,
2、张祺玲2,王振2,邓明2,王克勤2*,刘素纯1*(1.湖南农业大学食品科学技术学院,长沙 410125;2.湖南省农业科学院,湖南省核农学与航天育种研究所,长沙 410125)摘要:本试验利用电子束及射线两种射线对渐狭蜡蚧菌(Lecanicillium attenuatum)3166进行诱变处理,研究适于渐狭蜡蚧菌诱变选育的吸收剂量以及诱变菌株生物学特性。结果表明:电子束及射线诱变渐狭蜡蚧菌的最适剂量均为200 Gy,渐狭蜡蚧菌的电子束辐射敏感性D10值为191 Gy、射线D10值为366 Gy;以产孢速率为指标筛选获得突变菌株8株,其中5株的菌丝生长及产孢速率较出发菌株显著提高,均为电子束诱
3、变所得,产孢速率分别较出发菌株提高了30.45%、31.55%、23.66%、64.83%、68.77%;诱变菌株的胞外几丁质酶比活在培养5 d时达到峰值,诱变株111、164、181的几丁质酶比活分别较出发菌株显著提高29.29%、54.45%、19.18%,其中164酶比活可达1 707.41 U/mg prot;胞外蛋白酶比活在培养7 d时达到峰值,111、164、181的蛋白酶比活分别较出发菌株显著提高17.98%、13.17%、16.50%,其中111酶比活达到30.71 U/mg prot,且渐狭蜡蚧菌诱变株生长速率与胞外酶比活有强相关性。本研究为渐狭蜡蚧菌后续的害虫防治及开发利用
4、提供了理论基础。关键词:渐狭蜡蚧菌;辐射诱变;突变菌株;生物学特性;胞外酶比活中图分类号:TL99;S476.1 文献标志码:A DOI:10.3969/j.issn.1007-7146.2023.05.006Screening of Lecanicillium attenuatum with High Growth Rate by Radiation Mutation and Its Biological CharacteristicsDUAN Keyi1,LIU An2,CHEN Liang2,WU Xiaofen2,QI Hui2,ZHANG Qiling2,WANG Zhen2,DEN
5、G Ming2,WANG Keqin2*,LIU Suchun1*(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410125,China;2.Engineering Technology Research Center of Agricultural Biological Irradiation,Hunan Institute of Nuclear Agricultural Science and Space Mutation Breeding,Hunan Academy of
6、Agricultural Sciences,Changsha 410125,China)Abstact:In this study,electron beam and-ray were used to mutagenize Lecanicillium attenuatum 3166,and the absorbed dose suitable for mutation breeding of Lecanicillium attenuatum and the biological characteristics of the mutagenized strain were studied.The
7、 results showed that the optimal dose for electron beam and-ray mutagenesis of Lecanicillium attenuatum was 200 Gy,the electron beam D10 value of Lecanicillium attenuatum was 191 Gy,and the-ray D10 value was 366 Gy;eight mutant strains were screened and obtained with spore production rate as the ind
8、ex.Among them,the hypha growth and spore production rate of five strains significantly increased compared with the parent strain,which were all obtained by electron beam mutagenesis.The spore production rate increased by 30.45%,31.55%,23.66%,64.83%and 68.77%respectively compared 激光生物学报432第 32 卷渐狭蜡蚧菌
9、(Lecanicillium attenuatum)属于子囊菌纲,肉座菌目,蜡蚧菌属1,是一类重要的虫生真菌,对蚜虫2-4、粉虱4-8、蚧虫9-10、蓟马 11 和线虫 12等都有致病作用,在生物防治上具有极大的潜力。对比其他生防真菌如绿僵菌、白僵菌,蜡蚧菌在制剂开发及商品利用方面研究较少,可能的原因之一是蜡蚧菌的生长较慢、大规模产孢力较弱。目前对蜡蚧菌的研究主要集中于分生孢子、产孢能力等生物学特性以及野生型蜡蚧菌防治害虫的方面,通过辐射诱变育种技术选育蜡蚧菌优良菌株的研究较少。辐射诱变具有较高的微生物变异率、突变方向多样、效率高等优点,是微生物菌种选育的一个重要技术途径13。王楠等14利用6
10、0Co-射线辐照诱变猴头菌尖端菌丝,获得一株生物量和菌丝多糖产量明显提高且性状稳定遗传的突变菌株。韩晶晶等15利用电子束辐照诱变,筛选出一株高产酒精酵母YF1。付玉洁等16采用电子束辐照诱变丙酮丁醇梭菌,并辅以胁迫试验,经筛选最终获得了一株突变菌株S10,其丁醇产量较出发菌株产量提高了10%。由此可见,通过60Co-射线和电子束辐照改变微生物的遗传结果和功能,筛选出具有特定性状的优良突变型微生物是选育微生物的重要手段。本研究通过电子束和60Co-射线两种射线辐射诱变渐狭蜡蚧菌,以产孢速率为指标初步筛选获得诱变菌株,从菌株生物学特性对比两种射线对菌株产生的影响,筛选出高产孢速率的诱变渐狭蜡蚧菌,
11、为蜡蚧菌诱变育种提供理论基础。1材料与方法1.1培养基基础培养基(高葡萄糖马铃薯琼脂培养基):葡萄糖5.0%、马铃薯浸粉0.5%、琼脂1.5%。筛选培养基(高葡萄糖马铃薯培养基):葡萄糖5.0%、马铃薯浸粉0.5%。几丁质酶诱导培养基:0.200%胶体几丁质、0.100%KH2PO4、0.200%Na2HPO4、0.030%NaCl、0.300%KNO3、0.030%MgSO4 7H2O、0.001%FeSO4和0.300%胰蛋白胨(tryptone)。蛋白酶诱导培养基:1.0%麦芽糖、0.5%蛋白胨、0.004 8%MgSO4、1.1%Na2HPO412H2O、1.2%NaH2PO42H2O
12、。1.2渐狭蜡蚧菌菌株诱变前处理选取培养适宜天数的蜡蚧菌平板,无菌生理盐水冲洗菌平板,收集洗下的粗孢液,通过过滤装置滤去菌丝,得到单孢子悬液并计数。调整浓度至106 CFU/mL,分装为10 mL每离心管。于室温条件下分别用10 MeV电子加速器及60Co-射线(辐射源活度为2.961016 Bq)辐照处理,辐照设计剂量分别为0(对照)、50(仅电子束)、100、200、400、600、800、1 000、1 200、1 500、2 000 Gy。每个剂量辐照2管。1.3 渐狭蜡蚧菌辐射敏感性(D10)测定及致死率计算将辐照后的孢悬液参考GB 4789.15 201617中的方法进行平板计数,
13、计算不同辐照吸收剂量处理孢悬液的活孢数,并以0 Gy(未辐照)孢悬液为空白对照。以辐照吸收剂量为横坐标(x),活孢浓度的lg值为纵坐标(y)作图,计算渐狭蜡蚧菌在60Co-射线和电子束辐射下的D10值。同时计算致死率,公式如式(1)。致死率/%=未诱变平板菌落数-诱变后平板菌落数 未诱变平板菌落数 100%(1)1.4渐狭蜡蚧菌辐照后菌株初筛与复筛挑取致死率在80%90%计数平板中的单菌with the parent strain.The extracellular chitinase activity of the mutant strain reached the peak after f
14、ive days of culture,and the chitinase activities of mutant strains 111,164 and 181 increased by 29.29%,54.45%and 19.18%respectively,com-pared with that of the parent strain.The chitinase activity of mutant strain 164 reached 1 707.41 U/mg prot;the extracellular protease activity reached its peak aft
15、er 7-day culture,and the protease activities of 111,164 and 181 were significantly increased by 17.98%,13.17%and 16.50%respectively as compared with those of the parent strain,wherein the enzyme activ-ity of 111 could reach 30.71 U/mg prot,and the growth rate of the mutant strain had a strong correl
16、ation with the extracellular enzyme activity.This study provides a theoretical basis for the follow-up pest control,development and utilization of Lecanicil-lium attenuatum.Key words:Lecanicillium attenuatum;radiation mutagenesis;mutagenized strain;biological property;extracellular enzyme specific a
17、ctivity (Acta Laser Biology Sinica,2023,32(5):431-440)433第 5 期落于基础培养基斜面纯培养,记为0代,并对其编号。培养后刮取孢子接种1代菌平板,按照1.2中方法制备浓度为103 CFU/mL孢悬液,吸取1 mL孢悬液接种于筛选培养基中,28、220 r/min培养96 h,每株菌2个平行。计算菌株096 h的产孢速率,作为筛选指标,选取产孢速率显著提高的菌株,得到初筛的高产孢速率诱变株;再以同样的方法复筛出产孢速率较高的菌株进行后续试验。1.5渐狭蜡蚧菌菌丝生长特性的测定使用6 mm打孔器于基础培养基中央半打孔,留出沟壑。调整孢悬液浓度
18、为107 CFU/mL,吸取10 L孢悬液接种于培养基中央圆饼位置,静置片刻,于(280.5)下培养,第3天开始采用十字交叉法每天测量菌落直径,测量至第8天,每株菌3个重复。1.6渐狭蜡蚧菌诱变菌株遗传稳定性的测定以诱变后挑选出来的初次接种的菌落为突变菌株0代,转接至斜面纯培养的突变菌株为1代,用于后续试验的菌株均为突变菌株2代。制备浓度为107 CFU/mL的诱变菌株2代孢悬液,取1 mL孢悬液接种至液体培养基中28、220 r/min培养72 h,培养后的孢液过滤去菌丝,调整浓度为107 CFU/mL,取1 mL接种至新培养基,培养条件同上一代,重复至传代6次,获得诱变菌株的第8代。对比菌
19、株第2代和第8代的产孢速率,评估诱变菌株产孢的遗传稳定性。1.7渐狭蜡蚧菌几丁质酶比活的测定几丁质粉10 g加入100 mL 85%的磷酸,充分溶解,放入4冰箱中溶胀24 h后将混合液倒入大烧杯,加入蒸馏水搅匀后5 000 r/min离心10 min,弃上清液,水洗沉淀,反复离心、水洗至pH 5.5,蒸馏水定容至1 000 mL,得到终质量分数为1%的胶体几丁质。配制几丁质诱导培养基,调pH至5.5,0.15 MPa、121灭菌30 min后冷却备用。按照1.2的方法制备蜡蚧菌孢悬液,调整孢悬液浓度为106 CFU/mL,将1 mL孢悬液接种于几丁质酶诱导培养基中,置于摇床28、220 r/m
20、in培养。培养后取1 mL发酵液5 000 r/min 离心15 min,取上清液-80冷冻保藏待用。几丁质酶活的测定采用Solarbio几丁质酶活性检测试剂盒,蛋白浓度测定采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(微量法)。根据N-乙酰氨基葡萄糖标准曲线计算酶活性。酶比活力按照总蛋白浓度计算,定义为 37下,每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1 g N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶比活性单位。1.8渐狭蜡蚧菌蛋白酶比活测定配制106 CFU/mL孢子悬液,取1 mL接入蛋白酶液体诱导培养基中,28、220 r/min条件下培养,6 000 r/min离心10 min,取上清液,-80冷冻待用。蛋白酶活的测定
21、参照相关文献18-20方法,在275 nm波长下测定反应液的吸光值,根据酪氨酸标准曲线计算蛋白酶活性,每组3个平行;蛋白浓度测定采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(微量法);酶比活力按照总蛋白浓度计算,定义为37下,每毫克蛋白每分钟分解酪蛋白产生酪氨酸的酶量为一个酶比活性单位。1.9数据处理采用SPSS 21.0 软件进行数据处理,单因素ANOVA检验(显著水平P0.05即有统计学意义)和成对样本t检验进行显著性分析。作图采用Ori-gin2022等软件。2 结果与分析2.1电子束及60Co-射线辐照对渐狭蜡蚧菌辐照敏感度的影响及辐照诱变剂量的确定如图1a所示,电子束辐照吸收剂量与渐狭蜡蚧菌存活率的
22、lg值关系曲线为y=-0.005 4x+6.132 7,R2=0.982 7;60Co-射线辐照吸收剂量与渐狭蜡蚧菌存活率的lg值关系曲线为:y=-0.001 8x+4.959 6,R2=0.857 7;依据公式算出电子束辐照吸收剂量的D10值为191 Gy,60Co-射线辐照吸收剂量的D10值为366 Gy,说明本研究中的渐狭蜡蚧菌对电子束辐射更敏感。由图1b可知,两种射线在辐照吸收剂量达到400600 Gy时对渐狭蜡蚧菌的影响开始保持同步,致死率均达到90%100%,与徐岩21和张变英22的研究结果一致。前人研究认为,选择致死率为80%90%的诱变菌株纯化分离,获得正突变菌株的概率更高,因
23、此,本试验中电子束及60Co-射线辐照渐狭蜡蚧菌的适宜诱变剂量为200 Gy23-24。2.2诱变菌株产孢速率的初筛及复筛将辐照后的孢子悬液分别稀释104、105、106倍,涂布于基础培养基平板中,28恒温培养4 d,挑出生长良好的菌落于基础培养基斜面中纯培养,共分离电子束诱变单菌株200株,60Co-射线诱变单页眉文章标题段珂屹等:辐射诱变筛选高生长速率的渐狭蜡蚧菌及其生物学特性研究段珂屹等:辐射诱变筛选高生长速率的渐狭蜡蚧菌及其生物学特性研究激光生物学报434第 32 卷菌株110株。根据1.4的方法,初筛得到29株产孢速率较高的电子束诱变株,12 株产孢速率较高的60Co-射线诱变株。然
24、后对41株初筛菌株用同样的筛选方法进行复筛,得到6株产孢速率较高的电子束诱变株,产孢速率分别较出发菌株CK提高了30.45%、31.55%、7.89%、23.66%、64.83%、68.77%。另外,得到了2株60Co-射线诱变株,但复筛时产孢速率较低;其中菌株164和181 的产孢速率在统计学上显著高于其他菌株(P0.01),结果见图2。2.3电子束及60Co-射线辐照诱变对渐狭蜡蚧菌生长特性的影响2.3.1电子束及60Co-射线辐照对渐狭蜡蚧菌菌落生长速度的影响由图 3 可知,8 株诱变菌株生长趋势与CK一致,其中164、111号菌株培养68 d时的菌落直径均显著高于CK。培养5 d时,诱
25、变菌落直径最图160Co-射线辐照后渐狭蜡蚧菌的存活曲线Fig.1Mutagenesis curve of Lecanicillium attenuatum by electron beam and 60Co-ray(a)辐照吸收剂量对渐狭蜡蚧菌存活量曲线;(b)辐照诱变渐狭蜡蚧菌致死率曲线。(a)Curve of radiation absorbed dose against the survival of Lecanicillium attenuatum;(b)A lethality curve of that radiation mutagenesis Lecanicillium att
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- 辐射 诱变 筛选 生长 速率 渐狭蜡蚧菌 及其 生物学 特性 研究