氟尼辛葡甲胺对麦洼牦牛肠道菌群多样性的影响.pdf
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1、54卷南 方 农 业 学 报 1520氟尼辛葡甲胺对麦洼牦牛肠道菌群多样性的影响张咪1,仁科2,汪露1,索郎扎西2,陈朝喜1*(1西南民族大学畜牧兽医学院,四川成都610041;2若尔盖县藏兽医药研究所,四川阿坝州624504)摘要:【目的】探究口服给药氟尼辛葡甲胺对牦牛肠道菌群结构变化的影响,为氟尼辛葡甲胺在麦洼牦牛炎症性疾病治疗中的科学用药提供参考依据。【方法】麦洼牦牛按0.04 mL/kg的剂量灌服5%氟尼辛葡甲胺溶液,给药前后12 h内根据动物排便情况随时采样,以通用引物343F和798R扩增细菌16S rRNA序列V3V4可变区,构建PE文库后利用Illumia测序技术对粪便样本进行
2、微生物多样性分析。【结果】在PE文库覆盖率超过96.00%的条件下,各组粪便样本的OTU数量分布在16332435个,除幼龄麦洼牦牛给药后的OTU数量降低外,青壮年和大龄麦洼牦牛的OTU数量均有不同程度升高。在门分类水平上,给药前后麦洼牦牛粪便菌群结构组成中均以厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)为优势菌群,变形杆菌门(Proteobacteria)相对丰度在给药后明显降低,而厚壁菌门/拟杆菌门的比例有不同程度升高趋势,尤其以幼龄麦洼牦牛最明显;在属分类水平上,除幼龄麦洼牦牛粪便Ruminococcaceae_UCG-014、青壮年麦洼牦牛粪便Prevote
3、llaceae_UCG-004和大龄麦洼牦牛粪便Rikenellaceae_RC9_gut_group的相对丰度变化不明显外,其他菌属在不同年龄段麦洼牦牛粪便菌群结构组成中的相对丰度在给药前后均发生明显变化。给药后各组麦洼牦牛粪便样本中实际观测到的OTUs数量及Chao1指数和Shannon指数均呈不同程度的降低趋势,而Simpson指数的变化不明显。多元变量统计分析(Kruskal-Wallis和LEfSe)结果表明,在门分类水平上各组间差异较明显的有拟杆菌门、纤维杆菌门(Fibrobacteres)、厚壁菌门、梭杆菌门(Fusobazcteria)和Kieitimatiellaeota等;
4、在属分类水平上各组间差异明显的主要有 Eubacterium _coprostanoligenes_group、拟杆菌属(Bacteroides)和Christensenellaceae_R-7_group等。【结论】单次灌服氟尼辛葡甲胺后,麦洼牦牛肠道菌群在门和属分类水平上均发生不同程度变化,但仍以厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌群,表明氟尼辛葡甲胺仅影响麦洼牦牛肠道菌群的相对丰度。关键词:麦洼牦牛;氟尼辛葡甲胺;肠道菌群多样性;药理作用中图分类号:S823.85文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)05-1520-09收稿日期:2022-05-28基金项目:四川省科技培训项目(2
5、016KZ0007);四川省自然科学基金项目(2023NSFSC0179);西南民族大学研究生创新型科研项目(CX2021SZ64)通讯作者:陈朝喜(1980-),https:/orcid.org/0000-0002-6632-859X,博士,副教授,主要从事兽医药理学与毒理学研究工作,E-mail:第一作者:张咪(1996-),https:/orcid.org/0000-0002-1568-6012,研究方向为藏兽医药理学,E-mail:南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(5):1520-1528ISSN 2095-1191;CODEN
6、NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.05.024Effects of flunixin meglumine on intestinal flora diversityin Maiwa yaksZHANG Mi1,REN Ke2,WANG Lu1,Suolangzhaxi2,CHEN Chao-xi1*(1College ofAnimal and Veterinary Sciences,Southwest Minzu University,Chengdu,Sichuan 610041,China;2Institute of Tibetan
7、Veterinary Medicine in Ruoergai,Aba,Sichuan 624504,China)Abstracts:【Objective】The purpose of the study was to investigate the effects of oral administration of flunixin meglu-mine on the structural changes of intestinal flora of yaks,and to provide a reference basis for the scientific use of flunixi
8、nmeglumine in the treatment of inflammatory diseases in Maiwa yaks.【Method】The Maiwa yaks were orally administratedwith 5%flunixin meglumine solution at a dose of 0.04 mL/kg,and the fecal samples were collected at any time within 12h before and after administration of the drug according to the defec
9、ation situation of the animals,and the bacterial V3-V4variable region of 16S rRNA sequences were amplified with universal primers 343F and 798R,and the microbial diversityanalysis of fecal samples was performed by Illumia sequencing after the PE library was constructed.【Result】Under thecondition tha
10、t the coverage rate of PE library was over 96.00%,the OTU quantity of fecal samples in each group wasdistributed between 1633-2435,except for the decrease in OTU number after administration in young Maiwa yaks,theOTU number of young and middle-aged Maiwa yaks and old Maiwa yaks increased to varying
11、degrees.At the phylum5期15210引言【研究意义】麦洼牦牛是川西北高原的地方性优良牦牛品种,主要生长在四川省阿坝州红原县的麦洼、瓦切、唐克、壤口等乡(镇)及其周边区域,为牧民提供肉、奶等生活资料的同时可作为主要的运输工具,在牧区的生产生活中发挥重要作用。近年来,肠道感染性疾病已成为影响牦牛健康生长的主要因素,严重威胁其生长繁殖的同时对肠道微生物多样性也造成不同程度的影响。肠道微生物与宿主的营养代谢、免疫系统等生理生化活动息息相关(李晓斌等,2020;赵祯等,2020;徐俊等,2021),尤其是共生肠道细菌与炎症性肠道疾病密切相关(Honda andLittman,2016
12、;Ni et al.,2017;辛可启等,2020)。氟尼辛葡甲胺(Flunixin meglumine)为动物专用解热镇痛抗炎药物,2007年原农业部批准氟尼辛葡甲胺注射液用于家畜及小动物发热性、炎症性疾病和肌肉疼痛,美国食品药品监督管理局(FDA)也批准可用于牛呼吸系统疾病、内毒素血症及急性奶牛乳房炎引起的发热。因此,明确麦洼牦牛服用氟尼辛葡甲胺前后肠道微生物多样性的变化规律,可为氟尼辛葡甲胺在麦洼牦牛养殖过程中的科学用药提供理论依据和数据支持。【前人研究进展】目前,针对麦洼牦牛的研究主要集中在遗传育种、生产性状改良及其肉质品质改善等方面(谢荣清等,2006;柴志欣等,2013;符梅等,2
13、014),有关肠道传染性疾病的系统研究相对较少。肠道炎症性疾病尤其是以腹泻疾病为主的传染病对牦牛养殖已造成巨大经济损失,困扰着牦牛养殖业的可持续健康发展(韩照清,2016;陈朝喜等,2017)。虽然以抗生素为代表的化学药物在对症治疗等方面发挥着不可比拟的作用,但仍需采取必要措施以彻底消除炎症反应。氟尼辛葡甲胺因具有解热、镇痛和抗炎等药理学活性,在炎症性疾病治疗中已得到广泛应用(Chapinal et al.,2014)。李想等(2017)通过评估肌肉注射氟尼辛葡甲胺对母猪产后恢复的影响,结果表明大部分肌肉注射氟尼辛葡甲胺母猪的精神状态及外阴红肿等情况在产后第5 d得到恢复。王宏磊等(2019)
14、通过比较不同剂量氟尼辛葡甲胺对患呼吸道疾病奶牛的解热效果,发现静脉注射2.2 mg/kg的效果最佳。Walker等(2021)研究发现,经氟尼辛葡甲胺治疗后大肠杆菌性乳腺炎病牛的氧化应激标志物降低,炎症明显减轻。Martin等(2022)研究表明,对患有细菌性肺炎的病牛给药氟尼辛葡甲胺后其疼痛减轻。Schmitt等(2022)通过评价氟尼辛葡甲胺对荷斯坦奶牛产后健康的影响,发现氟尼辛葡甲胺对产后奶牛具有镇痛效果,能有效降低初产奶牛患子宫炎的风险。【本研究切入点】氟尼辛葡甲胺在兽医临床上多用于炎症性疾病治疗(Begg et al.,2004),鲜见用于牦牛炎症性疾病防治的报道,对于麦洼牦牛肠道微
15、生物多样性影响的研究仍是空白。【拟解决的关键问题】采用Illumia测序技术对麦洼牦牛的新鲜粪便样本进行微生物多样性分析,探究口服给药氟尼辛葡甲胺对牦牛肠道菌群结构变化的影响,为氟尼辛葡甲胺在麦洼牦牛炎症性疾病治疗中的科学用药提供参考依据。1材料与方法1.1动物给药及粪便样本采集试验于2019年10月底至11月初在四川省阿坝州classification level,Firmicutes and Bacteroidetes were the dominant phyla in the fecal flora of Maiwa yaks before andafter drug administ
16、ration,and the relative abundance of Proteobacteria greatly decreased after drug administration.Theratio of Firmicutes/Bacteroidetes tended to increase at varying degrees,especially in the young Maiwa yaks.At the genusclassification level,except for the relative abundance of Ruminococcaceae_UCG-014
17、in the young Maiwa yak feces,andPrevotellaceae_UCG-004 in middle-aged Maiwa yak feces and Rikenellaceae_RC9_gut_group in old Maiwa yak feces,which did not change greatly,the relative abundance of all other genera in in the structural composition of the fecal flora ofMaiwa yaks of different ages chan
18、ged largely before and after administration of the drug.The actual number of OTUsobserved in the fecal samples of Maiwai yaks in all groups and the Chao1 and Shannon indexes showed a tendency ofdecreasing to different degrees after the administration of the drug,whereas the changes in the Simpson in
19、dex were notobvious.The results of multivariate statistical analysis(Kruskal-Wallis and LEfSe)showed that Bacteroidetes,Fibrobac-teres,Firmicutes,Fusobazcteria aand Kiritimatiellaeota were more distinct among groups at the phylum classification level.At the genus level,there were great differences b
20、etween groups mainly in theEubacterium _coprostanoligenes_group,Bacteroides,and Christensenellaceae_R-7_group.【Conclusion】After single administration of flunixin meglumine,theintestinal flora of Maiwa yaks changes to varying degrees at the phylum and genus levels,Firmicutes and Bacteroidetesare the
21、dominant flora,indicating that flunisin meglumine only affects the relative abundance of intestinal flora in Maiwayaks.Key words:Maiwa yaks;flunixin meglumine;intestinal flora diversity;pharmacological effectFoundation items:Sichuan Provincial Science and Technology Training Project(2016KZ0007);Sich
22、uan NaturalScience Foundation(2023NSFSC0179);Graduate Students Innovative Research Projects in Southwest Minzu University(CX2021SZ64)张咪等:氟尼辛葡甲胺对麦洼牦牛肠道菌群多样性的影响54卷南 方 农 业 学 报 1522若尔盖县红星镇和阿西乡交界区域的麦洼牦牛牧场完成,按照不同年龄段 幼龄(1岁以下,41.83.8 kg)、青壮年(14岁,271.728.8 kg)和大龄(4岁以上,307.818.0 kg)分组进行采样,采样动物具体信息见表1。麦洼牦牛按0.0
23、4 mL/kg的剂量灌服5%氟尼辛葡甲胺溶液,给药前后12 h内根据动物排便情况随时采样,以一次性采便器采集粪便20 g左右,干冰保存并迅速带回实验室。1.2粪便样本处理及微生物多样性分析采用DNeasy PowerSoil Kit(100)试剂盒提取麦洼牦牛粪便总DNA,以NanoDrop 2000超微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度,A260/A280在1.5以上的样本-20 保存备用。利用细菌16SrRNA序列V3V4可变区通用引物343F(5-TACGGRAGGCAGCAG-3)和798R(5-AGGGTATCTAATCCT-3)进行PCR扩增,具体扩增程序:95 预变性
24、5 min;95 30 s,56 30 s,72 45 s,进行30个循环;72 延伸10 min,4 结束。PCR扩增产物均一化处理后,利用Illumina MiSeq平台完成测序分析。1.3统计分析Illumina MiSeq测序生成的原始序列(Raw data)经Trimmomatic v0.35切掉碱基质量平均值低于阈值的滑窗并去除小于50 bp的序列,通过Flash v1.2.11将合格的Raw data进行拼接,得到完整双端测序序列;利用QIIME中的Split_libraries v1.8.0去除双端测序序列中含N碱基序列和单碱基重复大于8及长度小于200 bp的序列,得到有效序
25、列(Clean data);以UCHIME v2.4.2去除嵌合体后得到可用于OTU划分的有效数据,再利用欧易自编程序对整个质控过程进行统计及OTU聚类分析。2结果与分析2.1麦洼牦牛粪便样本OTU统计及分布情况给药前后共收集30份麦洼牦牛粪便样本(给药前样本18份,给药后样本12份),经质控和去除嵌合体,可用于分析的数据量分布在2722835960 bp。各组粪便样本的OTU统计及分布情况如表2所示:在PE文库覆盖率超过96.00%的条件下,各组粪便样本的OTU数量分布在17852435个,除幼龄麦洼牦牛给药后的OTU数量降低外,青壮年和大龄麦洼牦牛的OTU数量均有不同程度升高,其中大龄麦洼
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