茯苓酸对人骨肉瘤细胞系MG-63的增殖凋亡、迁移侵袭影响及PERK_CCAAT信号通路调控作用.pdf
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1、山东医药2023 年第 63 卷第 30 期茯苓酸对人骨肉瘤细胞系MG-63的增殖凋亡、迁移侵袭影响及PERK/CCAAT信号通路调控作用施擎宇,黄帆,王冬明上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科,上海200032摘要:目的观察茯苓酸(PA)对人骨肉瘤细胞系MG-63增殖、迁移、凋亡和侵袭的影响,并探讨PA对蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)/CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)信号通路的调控作用。方法体外培养MG-63细胞,分为对照组、低浓度PA组(PA-L组)、中浓度PA组(PA-M组)、高浓度PA组(PA-H组)、高浓度PA+蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)抑制剂GSK2606414
2、组(PA-H+GSK2606414组),PA-L组、PA-M组及PA-H组分别用含20、40及80 mol/L PA的培养基培养,PA-H+GSK2606414组用含80 mol/L的PA和5 mol/L的GSK2606414培养基培养,对照组用空白培养基培养。分别于培养24、48、72 h时采用MTT法观察各组细胞增殖情况;培养24 h时采用细胞划痕实验观察各组细胞迁移情况;培养48 h时采用Transwell实验观察各组细胞侵袭情况;培养48 h时采用流式细胞术测算各组细胞凋亡率;培养48 h时,采用RT-qPCR法检测PERK及CHOP的mRNA表达,并采用WESTERN Blottin
3、g 法检测 PERK/CHOP 信号通路相关蛋白及凋亡相关蛋白真核生物起始因子 2(eIF2)、活化转录因子 4(ATF4)、CHOP、BCL2相关X蛋白(Bax)及B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)。结果与对照组比较,PA-M组及PA-H组培养48与72 h时细胞OD570nm值低、细胞迁移率低、细胞侵袭数少、细胞凋亡率高(P均0.05);与PA-M组相比,PA-H组培养48及72 h时的细胞OD570nm值低、细胞迁移率低、细胞侵袭数少、细胞凋亡率高(P均0.05);与PA-H组相比,PA-H+GSK2606414组细胞培养48及72 h时的OD570nm值高、细胞迁移率高、细胞侵袭数多、细胞
4、凋亡率低(P均0.05)。与对照组比较,PA-M组及PA-H组细胞PERK及CHOP mRNA相对表达量高,PERK及eIF2磷酸化水平高,ATF4、CHOP、Bax 蛋白相对表达量高,Bcl-2 相对表达量低(P 均0.05);与 PA-M 组相比,PA-H 组细胞 PERK 及CHOP mRNA相对表达量高,PERK及eIF2磷酸化水平高,ATF4、CHOP、Bax蛋白相对表达量高,Bcl-2相对表达量低(P均0.05);与PA-H组相比,PA-H+GSK2606414组细胞PERK及CHOP mRNA相对表达量低,PERK及eIF2磷酸化水平低,ATF4、CHOP、Bax蛋白相对表达量低
5、,Bcl-2相对表达量高(P均0.05)。结论PA可抑制MG-63细胞的增殖、迁移及侵袭,促进细胞凋亡。PA可能通过激活PERK/CHOP信号通路,抑制MG-63细胞的增殖迁移及侵袭,促进MG-63细胞的凋亡。关键词:茯苓酸;骨肉瘤;细胞增殖;细胞凋亡;细胞侵袭;蛋白激酶R样内质网激酶;CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2023.30.001 中图分类号:R285 文献标志码:A 文章编号:1002-266X(2023)30-0001-05Effects of pachymic acid on proliferation,apoptosi
6、s and invasion of osteosarcoma cells and its regulatory effect on PERK/CHOP signaling pathwaySHI Qingyu,HUANG Fan,WANG DongmingDepartment of Oncology,Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 200032,ChinaAbstract:Objective To investigate the effects
7、of pachymic acid(PA)on the proliferation,apoptosis and invasion of osteosarcoma cells and to explore its regulatory effect on the protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase(PERK)/CCAAT enhancer binding protein homologous protein(CHOP)signaling pathway.Methods MG-63 cells were cultured in vit
8、ro and were divided into the control group,low-concentration PA group(PA-L group),medium-concentration PA group(PA-M group),high-concentration PA group(PA-H group),and high-concentration PA+PERK inhibitor 论著 第一作者简介:施擎宇(1991-),女,硕士,中药师,主要研究方向为中药学(中药肿瘤学药理)。E-mail:通信作者简介:黄帆(1990-),男,学士,主管中药师,主要研究方向为中药学
9、(中药肿瘤学药理)。E-mail:开放科学(资源服务)标识码(OSID)1山东医药2023 年第 63 卷第 30 期GSK2606414 group(PA-H+GSK2606414 group),respectively.Cells in the PA-L group,PA-M group and PA-H group were cultured in medium containing 20,40 and 80 mol/L PA;cells in the PA-H+GSK2606414 group were cultured in medium containing 80 mol/L PA
10、 and 5 mol/L GSK2606414,and cells in the control group were cultured in the blank medium.The cell proliferation of each group was observed by MTT assay at 24,48 and 72 h,respectively;cell migration in each group was observed by cell Scratch test after 24 h culture;the cell invasion of each group was
11、 observed by Transwell assay after 48 h culture;the apoptosis rate of each group was measured by flow cytometry after 48 h;after 48 h of culture,the mRNA expression levels of PERK and CHOP were detected by RT-qPCR,PERK/CHOP signaling pathway related-proteins and apoptosis-related proteins eukaryotic
12、 initiation factor 2(eIF2),activating transcription factor 4(ATF4),CHOP,BCL2-associated X protein(Bax),and B-cell lymphoma-2(Bcl-2)were detected by Western blotting.Results Compared with the control group,the OD570nm values(48 h,72 h),cell mobility rates,invasion cells were lower,and the apoptosis r
13、ates were higher in the PA-M and PA-H groups(all P0.05).Compared with the PA-M group,the OD570nm values(48 h,72 h),cell mobility rates,invasion cells were lower,and the apoptosis rates were higher in the PA-H group(all P0.05).Compared with the PA-H group,PA-H+GSK2606414 group had higher OD570nm valu
14、es(48 h,72 h),higher cell mobility rate,more invasion cells and lower apoptosis rate(all P0.05).Compared with the control group,the relative expression levels of PERK and CHOP mRNA,PERK and eIF2 phosphorylation were higher,the relative expression levels of ATF4,CHOP and Bax were higher,and the relat
15、ive expression of Bcl-2 was lower in the PA-M and PA-H groups(all P0.05).Compared with the PA-M group,the relative expression levels of PERK and CHOP mRNA,PERK and eIF2 phosphorylation were higher,the relative expression levels of ATF4,CHOP and Bax were higher,and the relative expression of Bcl-2 wa
16、s lower in the PA-H group(all P0.05).Compared with the PA-H group,the relative expression levels of PERK and CHOP mRNA,PERK and eIF2 phosphorylation levels,the protein relative expression levels of ATF4,CHOP and Bax were lower,and the relative expression level of Bcl-2 was higher in the PA-H+GSK2606
17、414 group(all P0.05).Conclusion PA may inhibit the proliferation,invasion and migration,and promote apoptosis of MG-63 cells by activating PERK/CHOP signaling pathway.Key words:pachymic acid;osteosarcoma;cell proliferation;apoptosis;cell invasion;protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase;CC
18、AAT enhancer binding protein homologous protein骨肉瘤是骨科常见的恶性肿瘤之一,多发于股骨、胫骨、骨盆等部位,具有高度异质性1-2。目前临床治疗骨肉瘤主要方法有外科手术切除、放射治疗、化学药物治疗、靶向分子治疗等,但由于化疗药物的不良反应较多且严重,手术治疗后患者肢体功能表现差异加大,故寻找不良反应低、安全有效的新型治疗药物和治疗方法是目前的研究热点3-4。茯苓酸(pachymic acid,PA)是中药茯苓的主要活性成分,具有抗氧化、抗癌、抗炎、抗高血糖、抗病毒及镇静催眠等多种药理作用5。PA 可抑制胃癌、肝癌及乳腺癌等多种恶性肿瘤的增殖、迁移。
19、但 PA对骨肉瘤细胞增殖、侵袭及迁移的影响目前尚未有研究报道。在肿瘤细胞快速生长过程中,缺氧、营养物质匮乏等进一步导致大量未折叠或错误折叠的蛋白质聚集于内质网中,形成内质网应激,并启动未折叠蛋白反应(UPR)6。蛋白激酶 R样内质网激酶(PERK)/CCAAT增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/CHOP)信号通路在内质网应激中发挥重要作用,可通过上调 CHOP、Bcl-2和其他细胞凋亡因子的表达诱导细胞凋亡7-8。PA 是否通过调控 PERK/CHOP信号通路影响骨肉瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及凋亡,目前尚未有相关研究报道。为此,我们观察了 PA对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的影响,并探讨其
20、可能作用机制。1 材料与方法 1.1细胞、试剂及仪器人骨肉瘤细胞系 MG-63购自中国科学院细胞库。PA购自上海晶都生物技术有限公司;PERK抑制剂GSK2606414购自湖南华腾制药有限公司;胎牛血清、高糖DMEM培养基、胰蛋白酶购自美国Thermo Fisher公司;MTT试剂购自北京索莱宝科技有限公司;Transwell小室购自Corning公司;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒购自德国 Merck公司;TRIzol试剂、反转录试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒购自美国Invitrogen公司;RT-qPCR试剂盒购自康为世纪生物科技股份有限公司;PERK、p-PERK、真核
21、生物起始因子2(eIF2)、p-eIF2、活化转录因子4(ATF4)、CHOP、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、BCL2相关X蛋白(Bax)、GAPDH一抗和相应二抗购自上海艾博抗贸易有限公司。1.2PA受试浓度筛选取对数生长期的MG-63细胞接种于96孔板中(2104个/孔),分为5组,每组62山东医药2023 年第 63 卷第 30 期个 复 孔,加 入 终 浓 度 为 0、5、10、20、40、80、160 mol/L的PA处理48 h,每孔加入10 L的MTT溶液,孵育4 h,再加入100 L DMSO溶液,用酶标仪测算各组 570 nm 处吸光度值(OD570nm),测算各组细胞增殖
22、活力(%)。结果显示,与0 mol/L比较,40、80、160 mol/L 的 PA 可显著降低 MG-63 细胞的增殖活力(P 均0.05),且 160 mol/L 的 PA 对MG-63 细胞增殖活性的影响与 80 g/mL 的 PA 接近。因此,最终选择 20、40、80 mol/L 的 PA 进行后续实验。1.3MG-63细胞分组及PA给予方法取对数生长期 MG-63细胞,5103/孔接种于 96孔板中,待细胞贴壁后随机分为低浓度PA组(PA-L组)、中浓度PA组(PA-M组)、高浓度PA组(PA-H组)、高浓度PA+PERK 抑制剂 GSK2606414 组(PA-H+GSK2606
23、414组)及对照组,每组 6 个复孔。PA-L 组、PA-M 组、PA-H 组分别加入终浓度 20、40、80 mol/L 的 PA9培 养,PA-H+GSK2606414 组 加 入 终 浓 度40 mol/L 的 PA+5 mol/L 的 GSK260641410培养,对照组用空白培养基培养。1.4各组细胞增殖情况观察采用 MTT 法。分别于培养 24、48 及 72 h 时取各组细胞,每孔加入10 L 的 5 g/L MTT 溶液,继续培养 4 h 后弃上清,加入 100 L 的 DMSO 溶液,振摇后培养 10 min,待底部结晶完全溶解后,采用酶标仪测算 570 nm 处的吸光度 O
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