腐熟羊粪有机肥配施无机肥对植烟土壤微生物群落结构和多样性的影响.pdf
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1、土 壤(Soils),2023,55(4):804811 基金项目:河南省重点研发与推广专项(科技攻关)项目(212102110286),河南省烟草公司洛阳市公司项目(LYKJ202003)和河南中烟工业有限责任公司项目(2020410001340006)资助。*通讯作者(;)作者简介:温烜琳(1997),女,河南洛阳人,硕士研究生,主要研究方向为烟草栽培与土壤生态。E-mail: http:/ DOI:10.13758/ki.tr.2023.04.014 温烜琳,马宜林,周俊学,等.腐熟羊粪有机肥配施无机肥对植烟土壤微生物群落结构和多样性的影响.土壤,2023,55(4):804811.腐熟
2、羊粪有机肥配施无机肥对植烟土壤微生物群落结构和多样性的影响 温烜琳1,马宜林1,周俊学2*,高佳凯1,张水源3,张 枫3,申 欣4,王悦华1,申洪涛5,元 野6,李友军1,刘 领1*(1 河南科技大学农学院,河南洛阳 471023;2 河南省烟草公司洛阳市公司技术中心,河南洛阳 471000;3 河南省烟草公司洛阳市公司宜阳县分公司,河南宜阳 471600;4 河南省烟草公司洛阳市公司嵩县分公司,河南嵩县 471400;5 河南中烟工业有限责任公司技术中心,郑州 450000;6 黑龙江省烟草公司牡丹江烟草科学研究所,黑龙江牡丹江 157011)摘 要:为了探究腐熟羊粪有机肥与无机肥配施对洛阳
3、烟区植烟土壤微生物群落结构和土壤肥力特性的影响,采用盆栽控制试验和高通量测序技术,研究了不施肥(CK)、100%无机氮肥(T0)、50%羊粪有机肥氮+50%无机氮肥(T50)和 100%羊粪有机肥氮(T100)4 个处理下植烟土壤细菌和真菌群落结构及多样性的差异,并结合土壤理化性质分析了土壤肥力指标与土壤微生物多样性的关系。结果表明:植烟土壤细菌优势菌门为变形菌门(Proteobacteria)、酸杆菌门(Acidobacteria)和放线菌门(Actinobacteria),土壤真菌优势菌门为子囊菌门(Ascomycota)和担子菌门(Basidiomycota);T50 处理的变形菌门、酸
4、杆菌门和子囊菌门相对丰度最高,但放线菌门和担子菌门相对丰度最低;NMDS 分析和相似性分析发现,T50 处理的土壤微生物群落结构与其他处理差异显著;Alpha 多样性分析也表明,T50 处理土壤细菌和真菌群落的丰富度和多样性最高。不同处理土壤理化性质和土壤关键酶活性差异显著,以 T50 处理土壤养分含量和土壤碳氮代谢酶的活性最高;Pearson 相关性分析显示,土壤碱解氮、有效磷、速效钾含量及蛋白酶和脲酶活性与植烟土壤微生物多样的关系最为密切。总之,采用腐熟羊粪有机肥和无机肥配施通过影响植烟土壤细菌和真菌群落结构和多样性,促进了土壤养分的释放和转化,有利于土壤养分的供应和土壤质量的提升,研究结
5、果为洛阳烟区应用羊粪有机肥改良土壤提供了理论依据。关键词:腐熟羊粪有机肥;烤烟;土壤养分;土壤酶活性;细菌;真菌;多样性和群落组成 中图分类号:S572;S158 文献标志码:A Effects of Combined Application of Organic Manure and Inorganic Fertilizer on Structure and Diversity of Microbial Community in Tobacco-growing Soil WEN Xuanlin1,MA Yilin1,ZHOU Junxue2*,GAO Jiakai1,ZHANG Shuiyu
6、an3,ZHANG Feng3,SHEN Xin4,WANG Yuehua1,SHEN Hongtao5,YUAN Ye6,LI Youjun1,LIU Ling1*(1 College of Agriculture,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Henan 471023,China;2 Technology Center,Luoyang Branch of Henan Provincial Tobacco Corporation,Luoyang,Henan 471000,China;3 Yiyang Branch,Luo
7、yang Company of Henan Tobacco Company,Yiyang,Henan 471600,China;4 Songxian Branch,Luoyang Company of Henan Tobacco Company,Songxian,Henan 471400,China;5 Technology Center,China Tobacco Henan Industrial Limited Company,Zhengzhou 450000,China;6 Mudanjiang Tobacco Science Research Institute,Heilongjian
8、g Provincial Tobacco Company,Mudanjiang,Heilongjiang 157011,China)Abstract:In order to explore the influences of combined application of sheep manure-derived organic fertilizer and chemical fertilizer on soil microbial community structure and soil fertility in tobacco-growing area of Luoyang,a pot e
9、xperiment was conducted and high-throughput sequencing techniques was used to study the differences in community structure and diversity of soil bacteria and fungi under four fertilization treatments,no fertilizer(CK),100%inorganic nitrogen fertilizer(T0),50%sheep manure organic nitrogen fertilizer+
10、50%inorganic nitrogen fertilizer(T50),and 100%sheep manure organic nitrogen fertilizer 第 4 期 温烜琳等:腐熟羊粪有机肥配施无机肥对植烟土壤微生物群落结构和多样性的影响 805 http:/(T100).And the relationship between soil physiochemical properties and soil microbial diversity were analyzed.And the results showed that the dominant soil bact
11、eria phyla were Proteobacteria,Acidobacteria and Actinobacteria,while the dominant soil fungi phyla were Ascomycota and Basidiomycota.Compared with other treatments,T50 had the highest relative abundances in Proteobacteria,Acidobacteria and Ascomycota and the lowest relative abundances of in Actinob
12、acteria and Basidiomycota.NMDS analysis and similarity analysis showed that soil microbial community structure of T50 was significantly different from those of other treatments.Alpha diversity analysis also showed that T50 had the highest richness and diversity of bacterial and fungal communities.So
13、il physicochemical properties and soil key enzyme activities were significantly different under the four treatments,and T50 had the highest soil nutrient contents and soil carbon and nitrogen metabolizing enzyme activities.Pearson correlation analysis showed that soil alkali-hydrolyzed nitrogen,avai
14、lable phosphorus,available potassium,protease and urease activities were most closely related to soil microbial diversity.In summary,combined application of sheep manure-derived organic fertilizer and chemical fertilizers can promote the release and transformation of soil nutrients by affecting the
15、community structure and diversity of soil bacteria and fungi,which are conducive to the supply of soil nutrients and the improvement of soil quality.The results provide a theoretical basis for the application of sheep manure-derived organic fertilizer to improve soil quality in tobacco-growing areas
16、 of Luoyang.Key words:Sheep manure-derived organic fertilizer;Flue-cured tobacco;Soil nutrients;Soil enzyme activities;Soil bacteria;Soil fungi;Diversity and community composition 土壤微生物是土壤生态系统中重要的组成成分,在维持土壤生态系统平衡、促进土壤养分循环、保障作物正常生长发育方面发挥着重要作用,是反映土壤健康的重要指标1。前人研究发现,有机肥与化肥配施,能够增加土壤细菌和真菌群落的丰富度和多样性指数,改变土壤
17、微生物群落结构2-3。但是由于有机肥种类和土壤类型的不同,有机肥和化肥配施对土壤微生物的影响目前还存在较大差异。王庆等4研究发现,化肥减量配施有机肥能够增加土壤细菌的多样性,但对土壤真菌多样性没有影响;而李正辉等5研究则表明,羊粪有机肥的施用对土壤真菌的群落结构影响尤为显著。烤烟是我国重要的经济作物之一。近年来,由于无机肥料的不合理施用,造成土壤酸碱平衡失调、土壤生物活性降低以及土壤肥力下降等问题,严重影响了烟田的土壤健康和烟区的可持续发展6。施用有机肥能够降低土壤容重,改善土壤细菌群落结构和土壤养分供应能力,有利于土壤培肥和健康7-8。羊粪有机肥是常见的有机肥类型之一。前人研究表明,羊粪有机
18、肥替代化肥减量配施,能够改善土壤肥力,增加土壤微生物多样性,建立更适合作物生长的微生物区系9。然而,烟田配施羊粪有机肥对植烟土壤的改良效应及其微生态机制,仍不十分清楚。本课题前期研究发现,40%60%羊粪有机肥替代化肥与化肥配施能够促进烤烟生长发育,维持土壤肥力10,但是并未对土壤微生物多样性进行深入探究。因此,本研究采用高通量测序技术,进一步分析了腐熟羊粪有机肥与化肥配施对植烟土壤微生物群落结构和多样性的影响,旨在为洛阳烟区合理利用羊粪有机肥改良烟田土壤提供科学依据。1 材料与方法 1.1 试验材料 试验于 2019 年在河南省洛阳市河南科技大学进行。供试土壤釆自河南科技大学农场 0 20
19、cm 耕层,除去石子等杂物后风干过 2 mm 筛备用。土壤类型为黄潮土,基本理化性质为 pH 7.6,有机质 12.32 g/kg,全氮0.84 g/kg,碱解氮43.70 mg/kg,有效磷14.10 mg/kg,速效钾 102.10 mg/kg。供试烤烟品种为中烟 101,烟苗由洛阳市宜阳县烟草公司集中漂浮育苗。供试羊粪有机肥(有机质 497.0 g/kg、氮 14.2 g/kg、磷 13.2 g/kg、钾 24.4 g/kg)由河南正辉肥业有限公司生产;供试无机肥为复合肥(NP2O5K2O=181818)、过磷酸钙(P2O5,160 g/kg)和硫酸钾(K2O,500 g/kg)。1.2
20、 试验设计 试验采取盆栽受控试验,共设 4 个处理,分别为:CK(不施肥)、T0(100%无机氮肥)、T50(50%羊粪有机肥氮+50%无机氮肥)、T100(100%羊粪有机肥氮),每处理重复 4 次,共 16 盆。3 个施肥处理 T0、T50和T100,按NP2O5K2O=11.53进行配施,确保各处理氮、磷、钾等量施用,具体施肥比率和用量见表 1。于烟苗移栽 60 d 后,用抖根法采集烤烟根 806 土 壤 第 55 卷 http:/ 表 1 不同处理肥料配比和用量 Table 1 Fertilizer application ratios and dosages in different
21、 treatments N 来源(%)P2O5来源(%)K2O 来源(%)肥料施用量(g/pot)处理 羊粪 化肥 羊粪 化肥 羊粪 化肥 羊粪 复合肥 过磷酸钙 硫酸钾 CK T0 0 100 0 100 0 100 0.00 2.22 1.25 1.60 T50 50 50 31 69 29 71 14.08 1.11 1.34 1.31 T100 100 0 62 38 57 43 28.17 0.00 1.43 1.03 际土壤,混合均匀,一部分风干用于测定土壤养分含量和土壤酶活性,另一部分装入无菌离心管,放入液氮保存,用于 DNA 提取。1.3 测定项目与方法 参照鲍士旦11的方法测
22、定土壤有机质、碱解氮、有效磷和速效钾含量。参照关松萌12的方法测定土壤酶活性。其中,土壤蔗糖酶活性采用 3,5-二硝基水杨酸比色法测定,以 1 g 土壤在 37 培养 24 h 后生成的葡萄糖的质量(mg/(gd)表示;土壤蛋白酶活性采用加勒斯江法测定,以 1 g 土壤在 37 培养 24 h后生成的甘氨酸的质量(mg/(gd)表示;土壤脲酶活性采用苯酚钠次氯酸钠比色法测定,以 1 g 土壤在 37 培养 24 h 后产生的 NH3-N 的质量(mg/(gd)表示。采用土壤 DNA 提取试剂盒(Fast DNA Spin Kit for Soil)进行土壤DNA提取,将纯化后的基因组DNA作为
23、聚合酶链反应(PCR)的模板。细菌扩增引物采用515F(5-GTGCCAGCMGCCGCGG-3)和 907R(5-CC GTCAATTCMTTTRAGTTT-3),真菌 ITS1 区段扩增引物采用 ITS5(5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAG G-3)和 ITS4(5-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3)。PCR 采用 25 L 反应体系:10 倍 PCR buffer 5 L,dNTP 0.5 L,正向反向引物各 0.5 L,Tap 酶 0.25 L(250 U),DNA 模板 1 L,dH2O 补齐至 25 L。PCR反应策略:98预变性 3 min,98 15
24、s,50 30 s和 72 30 s,共 27 个循环;72延伸 10 min,4保存。Illumina PE250 测序:将同一样本的 PCR 产物混合后用 2%琼脂糖凝胶电泳检测,使用 AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN 公司)切胶回收 PCR 产物,Tris-HCl 洗脱;2%琼脂糖电泳检测。并用QuantiFluor-ST 蓝色荧光定量系统(Promega 公司)进行检测定量。使用 Illumina PE250 构建文库:连接“Y”字形接头;使用磁珠筛选去除接头自连片段;利用 PCR 扩增进行文库模板的富集;氢氧化钠变性,产生单链 DNA 片段。利用 Illumina 公
25、司的 PE250 平台进行测序(上海元莘生物医药科技有限公司)。1.4 数据处理与分析 使用 fastp13软件对原始测序序列进行质控,使用 FLASH14软件进行拼接:过滤 read 尾部质量值20 bp 以下的碱基,设置 50 bp 的窗口,如果窗口内的平均质量值低于 20 bp,从窗口开始截去后端碱基,过滤质控后 50 bp 以下的 read;根据 PE reads 之间的overlap关系,将成对reads拼接(merge)成一条序列,最小 overlap 长度为 10 bp;拼接序列的 overlap 区允许的最大错配比率为 0.2,筛除不符合序列;根据序列首尾两端的 barcode
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