负载脱落乳牙干细胞外泌体的透明质酸可注射水凝胶的制备及其对小鼠牙周炎抗炎成骨的研究.pdf
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1、口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 292 负载脱落乳牙干细胞外泌体的透明质酸可注射水凝胶的 制备及其对小鼠牙周炎抗炎成骨的研究应乔,俞懿强,苏俭生(同济大学口腔医学院,同济大学附属口腔医院口腔修复科,上海牙组织修复与再生工程技术研究中心,上海200072)摘要 目的:制备负载人脱落乳牙干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)外泌体(exosomes,EXO
2、)的可注射透明质酸(hyaluronic acid,HA)水凝胶,探究其在牙周炎中的抗炎及成骨作用。方法:提取 SHED 外泌体,以高分子量 HA 为基质,在其中负载 SHED 外泌体以合成可注射 HA 水凝胶(SHED-HA),并测定其降解率。采用CCK-8 法分析 SHED-HA 的生物相容性,应用实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)研究 SHED-HA 的成骨诱导作用及炎症抑制作用。随后,通过 micro-CT 来分析 SHED-HA 对小鼠牙槽骨缺损的挽救作用。结果:6%w/v 透明质酸
3、水凝胶具有较合适的降解性。CCK-8 结果显示,SHED-HA 具有较好的生物相容性能。RT-qPCR 结果显示,SHED-HA 组炎症基因 IL-1、IL-6 的表达水平下调,而成骨分化相关基因 Runx2、OPN、OCN 的表达水平上调。体内实验显示,SHED-HA 能减轻小鼠牙槽骨破坏。结论:成功构建负载了 SHED 外泌体的HA 水凝胶 SHED-HA,同时证实了其对小鼠牙周炎具有抗炎、成骨的作用。关键词透明质酸;脱落乳牙干细胞;外泌体;成骨分化中图分类号 R782 文献标志码 ADOI:10.12439/kqhm.1005-4979.2023.05.003Preparation of
4、 hyaluronic acid injectable hydrogel with SHED-derived exosomes and its anti-inflammatory and osteogenic effects on periodontitis:An experimental study in the ratYING Qiao,YU Yiqiang,SU Jiansheng(Department of Prosthodontics,Stomatological Hospital and Dental School of Tongji University,Shanghai Eng
5、ineering Research Center of Tooth Restoration and Regeneration,Shanghai 200072,China)Abstract Objective:Preparation of injectable hyaluronic acid(HA)hydrogels loaded with exosomes(EXO)of stem cells from human exfoliated deciduous teeth(SHED)to investigate its anti-inflammatory and osteogenic effects
6、 in periodontitis.Methods:SHED EXO was extracted and loaded with high molecular weight HA as matrix to synthesize injectable HA hydrogel(SHED-HA)and its degradation rate was determined.The biocompatibility of SHED-HA was analyzed by CCK-8 method,and the osteogenic induction and inflammatory inhibiti
7、on of SHED-HA were studied by real-time quantitative polymerase chain reaction(RT-qPCR).Subsequently,the effect of SHED-HA on alveolar bone defect in mice was analyzed by micro-CT.Results:SHED-HA had a suitable degradability at the concentration of 6%w/v HA.CCK-8 results showed that SHED-HA had good
8、 biocompatibility.RT-qPCR results showed that the expression levels of inflammatory genes IL-1 and IL-6 were down-regulated in the SHED-HA group,while the expression levels of osteogenic differentiation related genes Runx2,OPN and OCN were up-regulated.In vivo experiments showed that SHED-HA reduced
9、 alveolar bone destruction in mice.Conclusion:The HA hydrogel SHED-HA of SHED exosome was successfully constructed,and it was found that SHED-HA has 收稿日期:2022-01-21接受日期:2022-05-04基金项目:国家自然科学基金(81873715);上海市科学技术委员会项目(18441902100)作者简介:应乔,住院医师.E-mail:通信作者:苏俭生,教授.E-mail:基础研究口腔颌面外科杂志 2023 年 10 月 第 33 卷 第
10、 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 293 anti-inflammatory and osteogenic effects on mouse periodontitis.Keywordshyaluronic acid;deciduous tooth stem cells;exosome;osteogenic differentiation牙周炎是口内支持组织被广泛的炎症破坏而产生的疾病,能破坏牙龈、骨、牙周膜,进而导致牙齿的丢失,还可能导致全身的炎症1。牙周病的致病因素主要是微生物,由它
11、们形成的生物膜会导致牙周组织的高度损伤2。现最常用的治疗方法为外部机械治疗,但由于口腔结构与环境的复杂,如根分叉处等,器械常难以探及,使炎症控制存在一定的局限性3。除此之外,牙龈等软组织的损伤可以再生,然而牙周膜和牙槽骨的损伤在许多情况下却是不可逆的3-4。所以,牙周再生一直是牙周炎治疗的关键5。目前的临床治疗难以同时达到抗炎和再生的效果。近年来,透明质酸(HA)由于其特有的抗炎性和良好的流动性,被人们广泛用于关节炎的治疗。但在牙周炎的治疗方面,HA 及其复合材料用于牙周炎的体内实验相对较少6,HA 也缺乏足够的成骨性能。近年来的研究7表明,外泌体(EXO)在生命活动中扮演着重要的角色,如血管
12、生成、抗原表达、细胞凋亡、凝固、细胞内稳态、炎症和细胞间信号的传递。大量研究8-9证实,许多种类的外泌体具有成骨、组织分化和骨形成的作用。有学者10发现,脱落乳牙干细胞(SHED)来源的外泌体在口腔疾病中显示出潜在的治疗作用,而且 SHED 外泌体对于小鼠的牙周炎愈合也具有促进作用11。然而,外泌体溶液存在难以在口内长时间停留等问题,使其暂时还无法应用于临床。HA 作为载体与外泌体的联合应用,可以将外泌体长时间存在于局部位置,进而同时发挥成骨与抗炎作用。本研究利用 HA 水凝胶为药物缓释载体,联合SHED 外泌体制备一种可注射型水凝胶类复合材料,用于牙周炎的治疗。向 HA 水凝胶中加入 SHE
13、D 外泌体并将其应用于动物细胞和个体,通过 CCK-8 法分析其对人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)的生物相容性,采用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)研究其对 RAW264.7的 抗 炎 作 用 和 对 hPDLSCs 的 成 骨 分 化 诱 导 作用。最后,本研究建立小鼠牙周炎动物模型,运用micro-CT 技术,研究在体内 SHED-HA 水凝胶对牙周炎骨组织再生的促进作用。1材料和方法1.1hPDLSCs 和 SHED 的培养与 SHED 外泌体的提取hPDLSCs 取自同济大学附属口腔医院拔除的恒牙,将牙齿
14、置于超净台中,用无菌镊剥下牙齿根尖部残余附带组织,反复用磷酸盐缓冲液(phos-phate buffered saline,PBS)(Hyclone 公司,美国)冲洗,去除组织块表面血污,待组织块颜色微微发白时,将组织块平铺于培养瓶底部,培养瓶组织块面 向上,将充足的含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、2%双抗的 DMEM(Hyclone 公司,美国)完全培养液置于培养瓶底部,5%CO2、37 培养箱内培养 6 h,取出培养瓶翻转,使 DMEM 完全培养液与组织块完全接触,于 5%CO2、37 培养箱内培养,隔天换液。10 d 后显微镜下观察到有 hPDLSCs
15、爬出,继续培养。待细胞汇合度达到 70%时,胰蛋白酶(Hyclone 公司,美国)消化传代于 10 cm10 cm培养皿中,置于 5%CO2、37 培养箱内培养,隔天换液。待细胞汇合度达到 85%时消化传代。本实验采用第 2、3 代 hPDLSCs 进行试验。将 SHED(北京泰盛生物科技有限公司,中国)培养于含10%FBS、2%双抗的DMEM完全培养液中,置于 5%CO2、37 培养箱内培养,隔天换液。当细胞密度达 80%时行胰蛋白酶消化传代。当细胞量达 32 皿 10 cm10 cm 培养皿时,用不含血清的培养液进行换液,36 h 时取上清液。上清液在 300g 下离心 10 min,取上
16、清液,2 000g 离心 10 min。去除非贴壁细胞和碎片后收取上清液,上清液在 10 000g 下离心 60 min。取上清液,在 100 000g 下离心 70 min。缓慢倒去上清液,用 0.8 mL PBS 反复吹打重悬制成含 SHED 外泌体的 PBS 液,并用BCA 蛋白浓度测定盒(碧云天生物技术有限公司,中国)测定蛋白浓度。1.2复合材料 SHED-HA 水凝胶的制备及降解性实验将含 SHED 外泌体的 PBS 悬液加入去离子水中,配成 50 g/mL 的外泌体溶液。将 220 kDa 的HA 粉末(华熙生物科技有限公司,中国)按 1、2、口腔颌面外科杂志 2023 年 10
17、月 第 33 卷 第 5 期Journal of Oral and Maxillofacial Surgery Vol.33 No.5 October,2023 294 3 g/50 mL 溶于上述复合液中,于液相中缓缓倒入固相,同时反复搅拌,于 37 摇床内振荡过夜,形成含 SHED 外泌体的 2%、4%、6%w/v 的 HA 水凝胶,即 SHED-HA。分别取 2%、4%、6%w/v 的 HA 水凝胶 2 g,置于 15 mL 离心管中,于 1、2、3 d 后倒去管内液体并称质量。1.3细胞增殖的 CCK-8 实验选择 hPDLSCs 为实验细胞,将试样分为 2 组:control 组与
18、SHED-HA 材料组。将液相替换为正常培养液的材料,与正常培养液分别置于 24 孔板内,每孔设计 2 个副孔。将 hPDLSCs 按照 2104个/孔 接种于孔内,培养于 37 恒温培养箱中 1、3、7 d,隔天换液。于培养 1、3、7 d 时换液冲洗,加入含 10%CCK-8(碧云天生物技术有限公司,中国)溶液的DMEM基础培养液,于37 避光环境内孵育1 h,取上清液 100 L 加入 96 孔板内,每个样本设置 3 个 副孔,用酶标仪于 450 nm 波长处测量吸光度值。1.4RT-qPCR 检测1.4.1炎症相关基因的 RT-qPCR 分析实验分组为 control 组、脂多糖(li
19、popolysaccharide,LPS)刺激 组与SHED-HA材料组。将RAW264.7细胞按105个/板 铺于六孔板中,37 下培养 5 d。control 组于 DMEM完全培养液中培养 5 d,LPS 刺激组与 SHED-HA 材料组先用 0.01 LPS 刺激 1 d,然后 LPS 刺激组于DMEM 完全培养液中培养 4 d,SHED-HA 材料组以 2 mL/孔培养 4 d。5 d 后收集细胞,提取 mRNA,检测炎症因子白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)及白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)基因的表达。1.4.2hPDLSCs 成骨分化相关
20、基因的 RT-qPCR分 析实 验 分 组 为 control 组 和 SHED-HA 材 料组。将 hPDLSCs 按 4104个/孔铺于六孔板中,于 37 下培养 5 d。control 组用 DMEM 完全培养液培养 5 d,SHED-HA 材料组以 2 mL/孔培养 5 d。5 d 后收集细胞,提取 mRNA,检测成骨分化相关基因 Runx2、OPN、OCN 基因的表达。所选基因的引物序列见表 1。1.5动物实验动物实验程序经过同济大学附属口腔医院伦理委员会的批准 批准号:(2020)-DW-017。随机 选取 10 只 c57 雄性小鼠(雷根生物科技有限公司,中国),分为牙周炎组与材
21、料组。参考相关研究9,采用丝线结扎法建立牙周炎小鼠模型。用 7%水合氯醛(2 mL/只)麻醉动物后,选取型号 3-0 的外科缝线从小鼠右侧上颌第二磨牙近中和远中牙缝处进入,并绑于磨牙牙颈部,采用外科打结法紧密结扎,7 d 后拆除结扎线。实验样本分组如下:10 只小鼠的左上颌第二磨牙均未进行丝线结扎,为标准组;10 只小鼠的右上第二磨牙均采用丝线结扎处理,成功建立了牙周炎模型。丝线拆除后,其中5 只小鼠的右上第二磨牙没有给药,为牙周炎组;另外 5 只小鼠的右上第二磨牙隔天注射 SHED-HA水凝胶,为材料组。具体方法:小鼠麻醉后,将水凝胶注射于右上第二磨牙近远中牙颈部的牙周袋中。从拆线后开始注射
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