复方益生菌粉提高小鼠免疫力的实验研究.pdf
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1、456 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期3.2 流动相的选择参考中国药典2020年版一部中黄芪、淫羊藿及陈皮5和相关文献6-10,以乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-水梯度洗脱,乙腈-水等度洗脱。通过试验,结果以乙腈-0.2%甲酸溶液为流动相梯度洗脱,峰形好,4种成分分离度高,阴性样品干扰小。3.3 提取溶剂方法的选择参考文献2-10,试验中考察了甲醇、50%甲醇、70%甲醇、稀乙醇作为提取溶剂,以及加入不同体积(20,25,50 ml)的提取溶剂。结果用25 ml甲醇作为提取溶剂,提取率最高;考察了超声20,30,4
2、5,60 min,及回流45,60 min的提取效果,结果表明,加入25 ml甲醇超声处理30,60 min与回流60 min,测得的结果相差很小,因此选择操作简单的超声方法作为该试验的提取方法,省时、简便。参考文献1 肖展翅,江燕丽.甜梦胶囊联合黛力新治疗慢性失眠症的疗效与安全性J.中西医结合心脑血管病杂志,2017,15(5):624-626.2 柯桂萍,程葵.高效液相色谱法测定甜梦胶囊中淫羊藿苷的含量J.医药导报,2009,28(1):107-108.3 葛德洲,邓祖磊.高效液相色谱蒸发光散射法测定甜梦胶囊中黄芪甲苷含量J.中国药业,2015,24(5):31-32.4 高秀丽,曹恒仪,
3、王鹏娇.高效液相色谱法测定甜梦胶囊中淫羊藿苷的含量J.药物分析杂志,2007,27(12):1953-1955.5 国家药典委员会.中华人民共和国药典S.2020年版一部.北京:中国医药科技出版社:199-200,315-316,340-341.6 陈莉,王盛,孟楣.HPLC法测定含黄芪中药制剂中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量J.中国药房,2018,29(15):2041-2045.7 李想,卢静华.HPLC 法同时测定加味香连丸中芍药苷、柚皮苷、橙皮苷和黄芩苷J.中成药,2015,37(9):1955-1958.8 承晨,李莉.HPLC法同时测定代代花中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和辛弗林的含量J.药
4、学与临床研究,2020,28(4):263-265,269.9 宋青,郑晖,黄锦燕,等.HPLC同时测定和胃消痞丸中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和黄芩苷的含量J.食品与药品,2021,23(5):425-428.10 徐文芬,杨雯,何顺志,等.一测多评法测定淫羊藿中淫羊藿苷和朝藿定A、B、CJ.药学与临床研究,2016,47(1):130-137.收稿日期:2022-06-08基金项目:北京中医药大学纵向发展基金(编号:2018-zxfzjj-002,81373780)作者简介:刘柘君,硕士研究生,研究方向:中西医结合药理学,E-mail:*通讯作者:孙文燕,博士,副教授,研究方向:中药药理学,E
5、-mail:复方益生菌粉提高小鼠免疫力的实验研究刘柘君1,刘振权2,孙文燕2(1.北京中医药大学 中医学院,北京 100029;2.北京中医药大学 中药学院,北京 100029)摘 要:目的 探究鼠李糖乳杆菌R9639、干酪乳杆菌Zhang和植物乳杆菌P9三株益生菌组成的复方益生菌粉对小鼠免疫力的影响。方法 将小鼠分为阴性对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组各10只,并分别灌胃给予同等纯净水,0.21,0.42,1.25 mg/(kgd)复方益生菌,观察复方益生菌对小鼠体重、脏器/体重比、溶血素半数溶血值、抗体生成细胞数量、迟发型变态反应、淋巴细胞转化、碳廓清功能、腹腔巨噬细胞吞噬功能及
6、NK细胞活性的影响。结果 与阴性对照组比较,低、中、高剂量组小鼠体重、胸腺/体重比值和脾脏/体重比值差异均无统计学意义(P0.05);高剂量组小鼠的迟发型变态反应程度显著增加(P0.01);低、中、高剂量组小鼠的抗体生产细胞数量、溶血素半数溶血值、淋巴细胞增殖能力、NK细胞活性、碳廓清功能和腹腔巨噬细胞吞噬能力均显著增加(P0.01)。结论 复方益生菌粉能提高小鼠免疫力,结果符合保健食品检验与评价技术规范中“具有增强免疫力功能”的评价标准。关键词:益生菌;增强免疫力;体液免疫;细胞免疫;腹腔单核-巨噬细胞功能;NK细胞活性中图分类号:R96 文献标识码:A 文章编号:1672-979X(202
7、3)05-0456-06DOI:10.3969/j.issn.1672-979X.2023.05.016食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期 457Experimental Study of Compound Probiotic Powder on Improvement of Mices Immunity LIU Zhe-jun1,LIU Zhen-quan2,SUN Wen-yan2(1.School of Traditional Chinese Medicine,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 10
8、0029,China;2.School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)Abstract:Objective To explore the effect of compound probiotic powder composed of Lactobacillus rhamnosus R9639,Lactobacillus casei Zhang and Lactobacillus plantarum P9 on the immunity of mice.M
9、ethods Mice were divided into negative control group,low-dose group,middle-dose group and high-dose group,with 10 mice in each group,and were given the same amount of purified water,0.21 mg/(kgd),0.42 mg/(kgd)and 1.25 mg/(kgd)compound probiotic powder by gavage,respectively.The impacts of compound p
10、robiotic powder on body weight,organ/body weight ratio,hemolysin half hemolytic value,antibody-producing cells,delayed type hypersensitivity(DTH)reaction,lymphocyte transformation,carbon clearance function,phagocytosis function of peritoneal macrophages and NK cell activity were observed.Results Com
11、pared with the negative control group,there were no significant differences in body weight,spleen/body weight ratio and thymus/body weight ratio among the low,middle and high dose groups(P0.05).The delayed allergic degree of mice in high dose group increased(P0.01).The hemolysis value of hemolysin,n
12、umber of antibody-producing cells,lymphocyte proliferation,NK cell activity,carbon clearance ability and macrophage phagocytic ability in low,middle and high dose groups all increased(P0.01).Conclusion Compound probiotic powder can improve mices immunity from four aspects:humoral immunity,cellular i
13、mmunity,macrophage phagocytosis and NK cell activity.The test results are in line with the evaluation standard of“having the function of enhancing immunity”in Technical Specification for Inspection and Evaluation of Health Food.Key Words:probiotics;enhance ment of immunity;humoral immunity;cellular
14、immunity;intraperiloneal monocargon-macnophage function;NK cell activity益生菌是指一类对人体有益处的微生物有机体,通常在人体肠道黏膜中定植,发挥维持肠道生态平衡、增强机体免疫力等重要作用1。随着研究不断深入,益生菌用于消化系统肿瘤患者和手术患者预后的辅助用药2。中医学者则通常立足于脏象气血理论,认为人体“正气存内,邪不可干”,此处的“正气”即机体抵御病邪的能力,即西医中的免疫力一词,治法多着眼于扶正祛邪、补中益气3。本研究根据保健食品检验与评价技术规范中有关增强免疫力的检测方法,研究复方益生菌粉增强小鼠免疫力的效果。1 材
15、料与方法1.1 受试材料鼠李糖乳杆菌R9639(活菌数2000亿CFU/g)、干酪乳杆菌Zhang(活菌数2000亿CFU/g)及植物乳杆菌P9(活菌数2000亿CFU/g)(北京科拓恒通),按照质量比4:2:4比例混合。1.2 实验动物及给药SPF级ICR雌性小鼠200只,体重1822 g(北京维通利华),适应性饲养7 d后,随机分为A、B、C、D和E 5个大组,每大组再随机分为阴性对照组、低、中、高剂量组各10只,具体分组及各组实验项目见表1。表1 动物分组动物分组编号具体实验项目A迟发型变态反应(DTH)B血清溶血素半数溶血值、抗体生成细胞测定C淋巴细胞转化实验、NK细胞活性实验D小鼠腹
16、腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验E脏器/体重比值、碳廓清实验用纯净水配制浓度为0.21,0.42,1.25 mg/(kgd)复方益生菌粉,对低、中、高3个剂量组小鼠进行灌胃,阴性对照组灌胃给予同等体积纯净水。每日给药1次,连续灌胃30 d后各组对应实验项目进行检测。1.3 主要试剂和仪器RPMI1640培养基(批号:SH30809.01,Hyclone);四季青胎牛血清(批号:11011-8611,458 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第5期浙江天杭);CCK8试剂盒(批号:CA1210,北京百瑞极);刀豆蛋白A(ConA,批号:C8110),Hanks液,琼脂糖(批号:
17、A8530),台盼蓝染色液(批号:C0040-50),Giemsa染液(批号:G1015)(北京索莱宝),NP40(批号:N8030);绵羊红细胞(SRBC,批号:HQ80073),鸡红细胞(批号:HQ80071)(鸿泉生物);文奇氏试剂(批号:H1025,上海源叶);乳酸脱氢酶(LDH)测定试剂盒(批号:A020-2,南京建成生物工程研究所)。CO2培养箱(松下健康医疗器械);96孔板(美国康宁costar);倒置显微镜(日本OLYMPUS);油镜(日本OLYMPUS);低速离心机(北京北利时代);酶标仪(BIO-TEK)。1.4 实验方法1.4.1 小鼠体重差值及脏器/体重比 取小鼠胸腺和
18、脾脏称重,计算小鼠体重、胸腺/体重比值及脾脏/体重比值。1.4.2 小鼠体液免疫功能影响 1.4.2.1 血清溶血素半数溶血值(HC50)测定 于第31天对B组小鼠腹腔注射0.2 ml 的2%(V/V)SRBC,并于注射后第4 d摘眼球取血,置入离心管,离心1 h后收取上层血清。将血清稀释300倍后取50 l置于96孔板,依次加入25 l 10%(V/V)SRBC和50 l已制备好的补体,37 恒温培养箱30 min后终止反应并再次离心取0.05 ml上清,加文奇氏试剂0.15 ml作为样品。同时设半数溶血孔,取12.5 l 10%(V/V)SRBC,加文奇氏试剂至0.2 ml,各组试剂充分混
19、合,放置10 min后,于540 nm下测定各孔A值。溶血素具体数值以半数溶血值(HC50)表示,按式(1)计算。样品HC50=(A样品/Asrbc半数溶血)稀释倍数 (1)1.4.2.2 抗体生成细胞检测 将1 ml 压积SRBC加至5 ml空白小鼠血清中,于4 冰箱放置30 min,离心取上清,-70 保存作为补体待用。并于第31天对B组小鼠腹腔注射0.2 ml 的2%(V/V)SRBC,注射后第4天处死各组小鼠并取出脾脏于Hanks液中保存,磨碎脾脏筛网过滤并离心制成细胞悬液,细胞浓度调整为5106 个/ml,待用。将表层培养基加热溶解后置于45 水浴保温,与等体积 2倍浓度的Hanks
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