复合铁皮石斛多糖的胶原_壳聚糖支架对脊髓损伤大鼠的修复作用.pdf
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1、复合铁皮石斛多糖的胶原 壳聚糖支架对脊髓损伤大鼠的修复作用梅 赞,肖秀平,武焕颖,杜英杰,曹定岩(承德市中心医院神经外科,河北 承德;承德市中心医院老年病科,河北 承德;承德医学院中医学院,河北 承德)收稿日期:作者简介:梅 赞()男,硕士,主治医师,研究方向为神经外科。:,:通信作者:曹定岩()男,硕士,主治医师,研究方向为神经学。:,:摘要:目的 观察胶原 壳聚糖 铁皮石斛多糖支架对脊髓损伤大鼠的修复作用。方法 体外实验采用不同质量浓度铁皮石斛多糖干预骨髓间充质干细胞,法检测细胞增殖情况;在神经分化诱导的基础上,以不同质量浓度铁皮石斛多糖干预骨髓间充质干细胞,法检测神经元分化相关基因的表达
2、,同时进行吉姆萨染色与免疫荧光染色。体内实验将 只大鼠随机分为假手术组、模型组、胶原 壳聚糖支架组、铁皮石斛多糖支架组,每组 只,术后 周,评估大鼠后肢运动功能,对脊髓损伤区进行 染色、免疫组化染色。结果 一定质量浓度范围内的铁皮石斛多糖可促进骨髓间充质干细胞的增殖,促进神经元分化相关基因、表达,抑制 表达;细胞染色进一步证实铁皮石斛多糖可促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。与胶原 壳聚糖支架比较,胶原 壳聚糖 铁皮石斛多糖支架可进一步恢复脊髓损伤大鼠的后肢运动功能,缩小脊髓损伤空洞面积,增加神经元、神经纤维数量,抑制胶质瘢痕增生。结论 复合铁皮石斛多糖的胶原 壳聚糖支架可通过促进神经元的
3、再生、神经的再髓鞘化和轴突的生长,抑制星形胶质细胞瘢痕的产生,促进脊髓损伤后大鼠运动功能的恢复。关键词:铁皮石斛;壳聚糖支架;脊髓损伤;神经元再生;神经再髓鞘化;轴突生长中图分类号:文献标志码:文章编号:():脊髓损伤是一种致残率极高的中枢神经系统损伤,目前尚缺乏非常有效的治疗方法,如何采用干预措施促使缺损的神经元和轴突再生,并恢复功能性轴突的传导能力是脊髓损伤治疗的热点。近年来迅速发展的组织工程技术为脊髓损伤的治疗提供新的思路。组织工程中的支架不仅可以桥接脊髓损伤部位两侧的残端,还可以作为运送细胞、生物活性分子与药物的载体,可为干细胞提供一个三维的空间,促进其在体内的粘附、迁移和分化。大量动
4、物实验已证实,使用以生物材料为基础的支架可以一定程度上实现神经轴突及神经元的再生。壳聚糖具有无毒性、成本低廉、易于加工与良好的机械性能等优点,有利于中枢神经细胞和轴突的依附,有利于刺激神经细胞合成分泌生长因子及营养因子等,将其与胶原蛋白交联可提高支架的机械强度,同时解决其自身降解过慢的不足,是较为理想的组织工程支架。铁皮石斛自古以来就有“药中黄金”“救命仙草”“中华仙草”的美称,其主要药效成分为铁皮石斛多糖,具有增强免疫、抗氧化、抗衰老、抗感染、抗肿瘤、降血糖等广泛的生物学活性。沈鸿涛等研究证实,铁皮石斛多糖可抑制肿瘤坏死因子 ()引发的小鼠海马神经元细胞系()的凋亡;等研究表明,铁皮石斛多糖
5、有可能通过调节小胶质细胞的激活对阿尔茨海默症相关的认知障碍起到神经保护作用。以上研究显示,铁皮石斛多糖具有神经保护作用,但用于治疗脊髓损伤的报道不多见。本实验以胶原 壳聚糖支架为载体将铁皮石斛多糖应用于大鼠脊髓损伤部位,观察其修复效果。材料 细胞株 大鼠骨髓间充质干细胞,购自武汉普诺赛生命科技有限公司。药物与试剂铁皮石斛多糖(货号,纯度,相对分子量 ,南通飞宇生物科技有限公司)。壳聚糖(号,青岛博智汇力生物科技有限公司);试剂盒(货号,北京智杰方远科技有限公司);胎牛血清、培养基(货号、,南京生航生物技术有限公司);细胞培养添加剂(货号,上海恪敏生物科技有限公司);逆转录盒(货号,北京麦瑞博生
6、物科技有限公司);鼠抗 单抗、鼠抗 单抗(货号、,上海碧云天生物技术有限 公 司);鼠 抗、鼠 抗 (货 号、,南京莱富赛生物科技有限公司)。动物成年雄性 大鼠 只,体质量(),级,饲养于环境温度 ,相对湿度,昼夜交替,干燥通风的环境,每隔 更 年 月第 卷 第 期中 成 药 换垫料以确保清洁。方法 骨髓间充质干细胞增殖活性检测 将第 代骨髓间充质干细胞以每孔 个的密度接种于 孔板中,待细胞贴壁后,分别加入、铁皮石斛多糖溶液,设置 个复孔,以未干预的细胞为阴性对照,并设置空白对照孔。干预 后,每孔加入 溶液继续培养 ,采用酶标仪检测 波长处的吸光度值,绘制细胞生长曲线。诱导骨髓间充质干细胞向神
7、经样细胞分化 取生长状态良好的第 代骨髓间充质干细胞,分组诱导,阳性对照组加入含 、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子的 培养基,阴性对照组加入含 胎牛血清的 培养基,实验组在阳性对照组的基础上再加入、铁皮石斛多糖溶液,每 换液 次。诱导培养 后,采用 法检测、表达。同时,吉姆萨染色后于倒置显微镜下观察细胞形态变化,利用免疫荧光染色技术检测神经分化相关标记物 与 的表达。法检测、表达收集各组细胞,提取,检测 的浓度与纯度,利用 逆转录盒逆转录合成,反应体积为 。以逆转录所得 作为模板,用不同引物序列进行扩增。扩增条件为 ,个循环。结果采用 法分析,计算各组基因相对表达量。扩增引物序列见表。表
8、 引物序列基因正向引物反向引物 免疫荧光染色检测、荧光表达细胞按“”项下方法诱导培养 后,将细胞接种于盖玻片上,弃培养基,清洗 次,置于 多聚甲醛固定,溶液处理 ,清洗 次,过氧化氢处理 ,清洗 次,溶液封闭,清洗 次,分别置于鼠抗、单抗溶液()中 孵育过夜,清洗 次,置于、溶液中染色,用鬼笔环肽对细胞骨架进行复染,清洗 次,于荧光显微镜下观察。胶原 壳聚糖支架制备参考文献 报道方法制备胶原 壳聚糖支架,剔除新鲜牛腱的外膜与周围结缔组织,充分研磨粉碎后置于 缓冲液中浸泡,高速离心后收集白色沉淀,加入含消化蛋白酶的醋酸溶液溶解沉淀,充分溶解后取上清液,利用盐析法析出沉淀物,去离子水充分清洗溶解后
9、获得胶原蛋白凝胶。以醋酸溶液充分溶解壳聚糖粉末,将壳聚糖溶液与胶原蛋白凝胶以 比例混合,高速离心后去上清液,去离子水充分清洗,置于真空冷冻干燥机中干燥 ,溶液浸泡 ,去离子水反复清洗,再次冻干后 灭菌,即得。胶原 壳聚糖 铁皮石斛多糖支架制备将胶原 壳聚糖支架置于 铁皮石斛多糖溶液中浸泡 ,然后于 冰箱冷冻 ,最后真空冷冻干燥 ,即得。脊髓损伤模型制备大鼠腹腔注射 戊巴比妥钠麻醉,背部备皮后俯卧位固定于手术台上,显露 脊髓后切开硬脊膜,切除 脊髓组织,制作完全脊髓横断伴部分缺损模型;假手术组(只)大鼠仅暴露脊髓,未给予脊髓损伤操作。将造模后的大鼠随机分为模型组、胶原 壳聚糖支架组(脊髓损伤部位
10、植入胶原 壳聚糖支架)、铁皮石斛多糖支架组(脊髓损伤部位植入胶原 壳聚糖 铁皮石斛多糖支架),每组 只,逐层缝合。等待动物苏醒,术后分笼饲养。行为学评分 术后 周内,采用 评分评估大鼠的运动功能。将大鼠放入纸板试验箱内 ,轻敲板壁,使其自由爬行,观察损伤动物右后肢踝关节、膝关节、髋关节的活动范围和灵活程度,躯干运动及整体协调情况。所得评分越高说明大鼠运动功能恢复越好。组织病理学观察移植给药 周后,麻醉脱臼处死大鼠,心脏灌注后,以脊髓损伤点为中心截取 长的脊髓组织,置于 多聚甲醛中固定 ,脱水后制备组织冰冻切片(),染色观察脊髓损伤区生长情况,每个样本观察 个视野。常温晾干切片,置于丙酮(预冷)
11、中固定 ,清洗 次,于 过氧化氢中 孵育 ,清洗 次,于 甲酰胺和 倍枸橼酸钠杂交液内 处理 ,倍枸橼酸钠清洗 次,再用 清洗 次,加入 处理 ,硼酸缓冲液清洗 次,再用 清洗 次,牛血清蛋白 封闭,分别滴加鼠抗 ()、()、(),孵育 后,冰箱孵育过夜,次日 清洗 次,滴加生物素标记的兔抗鼠二抗 孵育 ,清洗 次,甘油封固后于显微镜下观察。利用 软件分析图片的阳性细胞计数,实验均重复 次。统计学分析 通过 软件进行处理,结果以()表示,多组间比较采用单因素方差分析,进一步比 年 月第 卷 第 期中 成 药 较采用 检验,两组间比较采用 检验。为差异有统计学意义。结果 铁皮石斛多糖对骨髓间充质
12、干细胞增殖活性的影响阴性对照组与、铁皮石斛多糖组细胞生长曲线基本呈“”形,第、天时细胞生长较缓慢,处于生长潜伏期;第 天起细胞进入快速增殖期,在第、天时进入增殖平台期,见图。铁皮石斛多糖组细胞在第 天处于增殖期,在第 天时呈现抑制增殖。根据细胞生长曲线可知,、铁皮石斛多糖组第 天细胞增殖率高于阴性对照组();铁皮石斛多糖组第 天细胞增殖率低于阴性对照组();铁皮石斛多糖组第 天细胞增殖率与阴性对照组比较差异无统计学意义()。铁皮石斛多糖对骨髓间充质干细胞向神经样细胞分化的影响 细胞诱导分化 后,与阴性对照组比较,阳性对照组、表达升高(),表达降低();与阳性对照组比较,铁皮石斛多糖组细胞、注:
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