附子中内源性组分新乌头碱的毒性作用.pdf
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1、收稿日期:.基金项目:国家重点研发计划项目(N o Y F C ).作者简介:陈锦萍(),女,硕士生.通信作者:郭岚(),女,研究员,博士.E m a i l:g u o l a n n c u e d u c n.陈锦萍,徐梦佳,郭娴,等附子中内源性组分新乌头碱的毒性作用J南昌大学学报(理科版),():CHE NJP,XU MJ,GUO X,e ta l T h et o x i c i t ye f f e c t so fe n d o g e n o u sc o m p o n e n tm e s a c o n i t i n ei na c o n i t i l a t e
2、r a l i sr a d i xp r a e p a r a t aJJ o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(N a t u r a lS c i e n c e),():附子中内源性组分新乌头碱的毒性作用陈锦萍,徐梦佳,郭娴,万益群,郭岚(南昌大学化学化工学院,江西 南昌 )摘要:探究了附子中内源性组分新乌头碱的急性毒性,为附子的安全使用提供一定的科学依据.将 只S P F级S D大鼠(雌雄各半),按体重随机分成 组,每组只,即个雄性对照组、个雄性给药组(、和 m gk g);个雌性对照组、个雌性给药组(、和 m gk g
3、).给药组一次性灌胃各剂量新乌头碱,对照组一次性灌胃等体积食用级玉米油.连续观察 d,并对大鼠的脏器指数、病理组织切片以及氧化应激能力进行分析.结果表明,新乌头碱对雄性大鼠和雌性大鼠的经口L D 分别为 和 m gk g.病理组织学分析结果表明,一定剂量的新乌头碱会对大鼠肝脏造成一定的损伤.氧化应激能力指标结果显示,雌性 m gk g组、雄性 m gk g组和雄性 m gk g组大鼠的肝脏i NO S指标与对照组相比显著升高(P 或P),进一步证实了一定剂量的新乌头碱会对大鼠肝脏造成损伤.关键词:附子;新乌头碱;大鼠;毒性作用;肝脏中图分类号:R 文献标志码:A文章编号:()T h e t o
4、 x i c i t ye f f e c t so f e n d o g e n o u s c o m p o n e n tm e s a c o n i t i n e i na c o n i t i l a t e r a l i s r a d i xp r a e p a r a t aCHE NJ i n p i n g,XU M e n g j i a,GUOX i a n,WANY i q u n,GUOL a n(S c h o o l o fC h e m i s t r ya n dC h e m i c a lE n g i n e e r i n g,N a
5、n c h a n gU n i v e r s i t y,N a n C h a n g ,C h i n a)A b s t r a c t:T h ea c u t e t o x i c i t yo fm e s a c o n i t i n e,t h em a i ne n d o g e n o u sc o m p o n e n t i na c o n i t i l a t e r a l i sr a d i xp r a e p a r a t a,w a se x p l o r e dt op r o v i d ea s c i e n t i f i c
6、 r e f e r e n c e f o r t h e s a f eu s eo f a c o n i t e F i f t yS P Fg r a d eS Dr a t s(h a l fm a l e a n dh a l f f e m a l e)w e r e r a n d o m l yd i v i d e i n t o g r o u p sa c c o r d i n gt ob o d yw e i g h t,w i t hr a t s i ne a c hg r o u p,n a m e l y,o n em a l e c o n t r o
7、l g r o u p,f o u rm a l ea d m i n i s t r a t i o ng r o u p s(,a n d m gk g,r e s p e c t i v e l y),o n ef e m a l ec o n t r o lg r o u p,a n df o u r f e m a l ea d m i n i s t r a t i o ng r o u p s(,a n d m gk g,r e s p e c t i v e l y)T h e r a t s i nt h ea d m i n i s t r a t i o ng r o u
8、 p sw e r e i n t r a g a s t r i c a l l ya d m i n i s t r a t e dw i t hm e s a c o n i t i n e a t d i f f e r e n t d o s e so n c e,a n d t h e r a t s i n t h e c o n t r o l g r o u p sw e r e i n t r a g a s t r i c a l l ya d m i n i s t r a t e dw i t he q u a l v o l u m eo f e d i b l e
9、c o r no i l T h er a t sw e r eo b s e r v e df o r c o n s e c u t i v ed a y s,a n dt h eo r g a nc o e f f i c i e n t,h i s t o p a t h o l o g i c a l s e c t i o na n do x i d a t i v es t r e s sc a p a c i t yw e r ea n a l y z e d T h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h eL D o fm e s a c
10、o n i t i n e i nm a l er a t sa n df e m a l er a t sw e r ea b o u t a n d m gk g,r e s p e c t i v e l y T h er e s u l t so fh i s t o p a t h o l o g i c a la n a l y s i ss h o w e dt h a tac e r t a i nd o s eo fm e s a c o n i t i n ew o u l dc a u s ec e r t a i nd a m a g e t ot h e l i v
11、e ro f r a t s T h e r e s u l t so f o x i d a t i v es t r e s sc a p a c i t y i n d i c a t o r ss h o w e dt h a t t h el i v e r i NO Si n d i c a t o r so f f e m a l er a t s i n m gk gg r o u p s,m a l er a t si n m gk ga n dm a l er a t s i n m gk gg r o u p sw e r es i g n i f i c a n t l
12、 yh i g h e r t h a nt h o s eo f t h ec o n t r o l g r o u p s(P o rP)I tw a s f u r t h e r c o n f i r m e dt h a t ac e r t a i nd o s eo fm e s a c o n i t i n ew o u l dc a u s e l i v e rd a m a g e i nr a t s K e yW o r d s:a c o n i t i l a t e r a l i sr a d i xp r a e p a r a t a;m e s a
13、 c o n i t i n e;r a t s;t o x i c i t ye f f e c t s;l i v e r乌头的侧根,在中国被称为“附子”,为毛茛科植物乌头(A c o n i t u mc a r m i c h a e l i iD e b x)的子根加工品,主要分布于四川、陕西、甘肃等地.附子味辛、甘,性大热,具有回阳救逆,补火助阳,散寒止痛等功效,在我国已有几千年的医用实践.神农本草经 中记载:附子主治风寒咳逆,邪气,温中,第 卷第期 年月南昌大学学报(理科版)J o u r n a l o fN a n c h a n gU n i v e r s i t y(N
14、 a t u r a lS c i e n c e)V o l N o A u g 金创,破徵坚积聚,血瘕,寒湿,痿躄,拘挛,膝痛不能步行.现代药理学研究表明,附子具有强心、抗心律失常等作用.附子中含有乌头类生物碱、黄酮以及多糖等多种组分,其中,乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等乌头生物碱是其重要的内源性组分,具有镇痛 、抗炎 、抗癫痫、抗抑郁、抗痴呆 抗肿瘤 、抗病毒、提高免疫功能 等多种生理活性.附子也具有一定的毒性,且安全系数窄,其治疗剂量接近于中毒剂量.有报道称,全球范围内由附子引起的中毒病例已超过 例,因此附子的安全性也受到了高度关注.有研究表明,乌头碱、次乌头碱以及新乌头碱等双酯型乌头生
15、物碱是其主要的毒性成分.Y eq i a n g等 研究了种双酯型乌头碱(乌头碱、新乌头碱、次乌头碱)和种单酯型乌头碱(苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱)对斑马鱼胚胎的生物效应,发现双酯型乌头碱的心脏毒性、器官毒性以及功能毒性均比单酯型乌头碱强.雷怀成 等发现乌头碱在给药后短时间内,会导致脑神经细胞、心肌细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞的凋亡数量明显增加.G a o等 研究认为乌头碱能通过部分线粒体依赖性凋亡途径诱导H c 心肌凋亡.都姣娇等 报道了心肌细胞的存活率会随着次乌头碱浓度的升高而下降.目前,附子中的乌头碱以及次乌头碱的毒性研究较多,而结构与乌头碱和次乌头碱有一定差别的新乌头
16、碱毒性评估报道较少,且主要集中在心肌细胞层面 .同时,毒性评估的方法和方案也不统一,导致结论有偏差.基于此,本文选择新乌头碱为研究对象,以S D大鼠为模型动物,依据 食品安全国家标准急性经口毒性试验(G B )中的霍恩氏法,开展新乌头碱对大鼠的急性经口毒性评价,并探究新乌头碱对于大鼠的主要脏器(包括心脏、肝脏以及肾脏)的毒性作用,为附子的安全使用提供一定的科学依据.实验部分主要试剂与材料新乌头碱(纯度 ,购自广东隽沐生物科技股份有限公司);玉米油(食品级);苏木素伊红染液购自武汉市皮诺飞生物科技有限公司;福尔马林中性固定液购自南昌雨露实验器材有限公司;B C A蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物
17、技术有限公司;丙二醛(MD A)试剂盒和磷酸盐缓冲液(P B S)购自白鲨生物科技有限公司;脂质过氧化物(L P O)和诱导型一氧化氮合成酶(i NO S)试剂盒购自南京建成科技有限公司.主要仪器与设备J J J型脱水机、J BB 型包埋机J BL 型冻台均购自于武汉俊杰电子有限公司;RM 型病理切片机购自于上海徕卡仪器有限公司;K DP型组织摊片机购自于浙江省金华市科迪仪器设备有限公司;DHG 型烤箱购自上海慧泰仪器制造有限公司;C型载玻片及盖玻片购自于江苏世泰实验器材有限公司;N I KONE C L I P S EC I型正置光学显微镜和N I KOND SU 型成像系统均购自日本尼康有
18、限公司;C L M型冷冻离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司;E 全波长多功能酶标仪购自美国T h e r m o公司.实验动物S P F级S D大鼠 只,雌雄各半,体重为 g.大鼠由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供,实验单位使用许可证编号为S Y X K(赣),动物许可证号为S C X K(湘).给药前,所有大鼠在试验环境中进行d环境适应,环境温度为,相对湿度 ,按性别分笼饲养,试验期间喂基础饲料,饲料由湖南嘉泰 实 验 动 物 有 限 公 司 提 供,饲 料 许 可 证 号 为S C X K(湘),自由饮水.实验方法动物给药S P F级S D大鼠 只,按性别随机分成 组,雄性和雌性均分
19、为个对照组和个给药组,每组只.给药组灌胃新乌头碱,雄性给药组剂量分别为、m gk g,雌性给药组剂量分别为 、m gk g,对照组灌胃相同体积的食用级玉米油.以上各组大鼠均按体质量 m Lk g一次性经口灌胃.灌胃前大鼠禁食 h左右,自由饮水,灌胃后,禁食h.之后自由饮食和饮水,持续观察 d.临床观察连续 d观察大鼠的毛发、眼部、皮肤、活动状态以及精神状态.在实验开始前以及实验结束后称大鼠的体重,并且每周称次体重.观察期内若发现动物死亡,立即解剖,肉眼观察其心脏、肝脏以及肾脏病理形态变化,并记录各组死亡大鼠数量.脏器指数的测定与分析 d实验结束后,对所有大鼠进行处死解剖,取心脏、肝脏以及肾脏并
20、且称重,计算各大鼠各个器官第期陈锦萍等:附子中内源性组分新乌头碱的毒性作用的脏器指数(脏器指数脏器重量/体重 ).采用S P S S 软件分析脏器指数的数据.用单因素方差分析法(ANOVA)分析两组间脏器指数数据的差异性.根据最小显著性差异法(L S D),P 为具有显著性差异,其中,P 为差异十分显著.组织病理学分析将解剖的心脏、肝脏、肾脏称重后用 的福尔马林固定液固定 h以上后,经过乙醇梯度脱水,石蜡包埋,切片机切片,苏木素伊红(HE)染色等一系列程序后,在光学显微镜下进行病理组织形态学研究.氧化应激能力指标的测定将解剖的大鼠肝脏、肾脏称重后于 冷藏 h以上,之后取一定量的肝脏组织和肾脏组
21、织,与一定比例的磷酸盐缓冲溶液(P B S)混合研磨后,按试剂盒规定的转速,在条件下离心,取上清液.接着使用相关试剂盒测定肝脏和肾脏的诱导型一氧化 氮 合 成 酶(i NO S)、肾 脏 的 脂 质 过 氧 化 物(L P O)以 及 肝 脏 的 丙 二 醛(MD A),之 后 采 用S P S S 软件分析氧化应激能力指标的数据.结果与讨论大鼠的一般状况对于雄性大鼠,大部分 低剂量给药 组(、m gk g)的大鼠在给药 h之内表现出呆滞、嗜睡、食欲下降等症状.少部分还出现震颤、惊厥、流涎、痉挛、叫声异常、昏迷、体位异常、流泪、鼻翼扇动竖毛等现象.h过后,除了个别表现呆滞的,其余皆恢复正常,食
22、欲增加,此两个剂量的大鼠无死亡.而中高剂量组(、m gk g)的大鼠给药后h内只大鼠皆不同程度地出现与低剂量给药组(、m gk g)一样的中毒症状,小部分还出现眼睛和鼻孔出血、流泪、抽搐.在给药h内,这两个给药组大鼠相继全部死亡.各组大鼠死亡数如表所示.对于雌性大鼠,给药剂量为 m gk g的大鼠在给药h之内出现昏睡、呆滞、震颤、心跳异常,食欲下降,其中只出现流涎和冷汗.h之后开始恢复正常,此剂量无大鼠死亡.剂量为 m gk g的大鼠在给药 h之内表现出呆滞、嗜睡、食欲下降等症状,少部分还出现流涎、痉挛、叫声异常、昏迷、体位异常、流泪、鼻翼扇动、竖毛、冷汗、腹泻、眼睛以及鼻孔出血等现象.h过后
23、恢复正常,食欲增加,此剂量组有只大鼠死亡.对于剂量为 和 m gk g的大鼠给药后h内只大鼠皆不同程度地出现震颤、惊厥、不安、痉挛、呆滞、嗜睡、昏迷、体位异常、叫声异常、竖毛、冷汗、鼻翼扇动、抽搐.一部分出现流涎、腹泻、眼睛以及鼻孔出血等现象.在给药h内,全部动物相继死亡.各组大鼠死亡数如表所示.解剖实验中死亡的大鼠,肉眼可见其心脏颜色变黑变暗甚至有变硬现象,而肝脏和肾脏未见有明显的改变.初步判断,新乌头碱在短时间内会对大鼠的心脏以及神经系统造成明显的作用.有研究报道乌头类生物碱对迷走神经有强烈的兴奋作用,释放出乙酰胆碱作用于心脏,极易形成室性混乱性心律,如室早、室速甚至室颤,也有文献指出双酯
24、型乌头生物碱可使心肌细胞内C a稳态失衡,从而引起心律失常,.本实验观察到的现象说明新乌头碱可能与其它乌头类生物碱一样,会影响大鼠的神经系统和心脏功能.给药组的雄性大鼠和雌性大鼠的死亡数分别见表和表,依据 食品安全国家标准急性经口毒性试验(G B )中L D 的测定方法,得出雄性大鼠的L D 约为 m gk g,雌性大鼠的L D 约为 m gk g.可以看出雄性比雌性的耐受性更强,造成这种差异的原因可能是与不同性别大鼠的身体组成、激素、肝脏代谢、肾脏清除能力、蛋白质结合与分布的差异有关 .表雄性大鼠各给药组的死亡数T a b D e a t hn u m b e ro fm a l e r a
25、 td o s eg r o u p剂量/(m gk g)死亡数/只 表雌性大鼠各给药组的死亡数T a b D e a t hn u m b e ro f f e m a l e r a td o s eg r o u p剂量/(m gk g)死亡数/只 新乌头碱对大鼠体重的影响在 d的观察期内,存活下来的各个剂量组的大鼠平均体重变化趋势见图.由图中可以看出,雄性大鼠给药组和雌性大鼠给药组的体重变化趋势与各自的对照组相比,均无明显差异.这说明单次南昌大学学报(理科版)年给药,如果大鼠能够存活下来,新乌头碱对大鼠的生长没有显著影响.350300250200150w/g1412108642016雄
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