复合益生菌发酵培养基与冻干保护剂的筛选.pdf
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1、第43卷第6 期2023年11月doi:10.19638/j.issn1671-1114.20230605天津师范大学学报(自然科学版)Journal of Tianjin Normal University(Natural Science Edition)Vol.43No.6Nov.2023复合益生菌发酵培养基与冻干保护剂的筛选张晓月,王涛1,左志晗1,孙家,刘洪瑞,张晶晶,孙金生!(1.天津师范大学生命科学学院,天津30 0 38 7;2.天津师范大学天津市动植物抗性重点实验室,天津30 0 38 7)摘要:为实现对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、格式乳球菌(Lacto
2、coccus garvieae)施氏假单胞菌(Pseudomonasstutzeri)和酵母菌(Yeast)4株水产养殖益生菌菌株的共发酵培养,进行了单一无机盐去除实验和冻干保护剂筛选实验.结果显示:4株益生菌复合发酵培养基的具体成分包括葡萄糖2 0 g、蛋白陈10 g、牛肉浸粉5g、酵母粉5g,硫酸镁0.1g、柠檬酸氢二铵2 g、磷酸氢二钾2 g、硫酸锰0.0 5g、吐温8 0 1mL、蒸馅水10 0 0 mL;枯草芽孢杆菌只有在去除乙酸钠的培养基中才会生长,去除乙酸钠对其余菌株生长影响不显著;当柠檬酸氢二铵、硫酸镁、磷酸氢二钾和硫酸锰4种无机盐在共发酵培养基中分别去除时均会对某些菌株的生长
3、造成抑制,所以4种无机盐在共发酵培养基中的添加十分必要;复合益生菌的最佳吸附剂为玉米粉,最佳冻干保护剂为脱脂奶粉,最佳使用质量分数为16%.关键词:复合益生菌;共发酵培养基;无机盐;吸附剂;冻干保护剂中图分类号:Q939.9Screening of compound probiotic fermentation medium andZHANG Xiaoyue,WANG Tao,ZUO Zhihan,SUN Jiacheng,LIU Hongrui?,(1.College of Life Sciences,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,Chin
4、a:2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China)Abstract:In order to realize the co-fermentation culture of four aquaculture probiotic strains including Bacillus subtilis,Lacto-coccus garvieae,Pseudomonas stutzeri and Yeast,the single inorgani
5、c salt removal experiment and freeze-drying protectiveagent screening experiment were carried out.The results were as follows:The specific components of the four-strain compoundfermentation medium included glucose 20 g,peptone 10 g,beef extract powder 5 g,yeast powder 5 g,Mgs04 0.1 g,diammo-nium hyd
6、rogen citrate 2 g,K,HP042 g,MnSO4 0.05 g,tween 80 1 mL and distilled water 1 000 mL.Bacillus subtilis can onlygrow in medium with sodium acetate removed,and the removal has no significant ffect on the growth of the remaining strains.When the four inorganic salts,i.e.diammonium hydrogen citrate,magne
7、sium sulfate,dipotassium hydrogen phosphate andmanganese sulfate were removed respectively in the co-fermentation medium,they would inhibit the growth of some strains,sothe addition of the four inorganic salts in the co-fermentation medium was very necessary.Through the comparative screeningexperime
8、nt of adsorbents and protective agents,it is determined that the best adsorbent for composite probiotics was corn flour,and the compound probiotic freeze-drying protective agent was skimmed milk powder,the best mass fraction of which was 16%.Keywords:compound probiotics;co-fermentation medium;inorga
9、nic salt;adsorbent;freeze-drying protective agent文献标志码:Afreeze-drying protective agentsZHANG Jingjing,SUN Jinsheng文章编号:16 7 1-1114(2 0 2 3)0 6-0 0 32-0 7水产养殖业中,益生菌由于能够在一定程度上促进动物生长,因此应用广泛1-2 ,尤其是利用益生菌发酵生产的饲料产品越来越受到养殖业的青3目前在水产养殖行业中应用的菌种比较乏且单一,收稿日期:2 0 2 2-0 8-0 6基金项目:天津市自然科学基金资助项目(19JCYBJC29700).第一作者:
10、张晓月(1998 一),女,硕士研究生:通信作者:左志晗(197 9),女,讲师,主要从事肠道微生物与水生动物宿主健康方面的研究.E-.可应用于水产养殖的菌种筛选也没有新的突破.摆脱菌种结构的单一性、提高应用效果是急需解决的重要问题4.益生菌制剂主要分为单一菌剂和复合菌剂,单一菌剂是指有效活菌是单一微生物的制剂,如芽孢杆第43 卷第6 期菌制剂、酵母菌制剂等,单一菌剂虽然针对性较强、发酵工艺简单,但作用效果比较单一,很难应对养殖环境复杂和水生生物疾病多样的情况.复合菌剂是指由2种以上微生物构成的制剂,如芽孢杆菌与乳酸菌组成的复合微生物添加剂5,复合菌剂不仅具有多种功效,且相较于单一菌剂使用效果
11、更加显著,但大多质量无法保证且无法满足养殖行业的需求.如有些复合益生菌的搭配不够科学,针对性不强,无法适用于不同的养殖环境和水体,常常不能够发挥其应有效果.益生菌制剂在饲料加工、运输、贮存过程中容易失去活性,也存在定植于动物肠道时间较短或仅少数能定植在肠壁发挥作用7 等问题,因此益生菌制剂的保存和制备方法尤为重要.菌种保存和发酵剂的制备是保证益生菌制剂能够正常发挥原有效果的保障,可以保证菌种活性,减少益生菌制剂在保存及运输过程中的活性损失8.现用于益生菌保存和制备的方法主要有真空干燥、冷冻干燥以及喷雾干燥法9.其中真空冷冻干燥技术具有适用范围广、存活率高、保藏时间长、菌种稳定性高的特点,同时在
12、储存和运输方面成本低且方便快捷10-12 ,是益生菌发酵剂制备较为理想的方法.可用于微生物冻干保护剂的物质有很多,按照保护剂的性质可分为多元醇类、糖类、蛋白质类、氨基酸和肽类13-14,要根据微生物的不同使用适合的保护剂种类和浓度才能够获得较好的保护作用.本课题组前期从健康水产动物肠道中分离筛选出了4株益生效果较好的动物内源性益生菌,即枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、格式乳球菌(Lactococcusgarvieae)施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和酵母菌(Yeast),本研究以4株菌为实验菌株,进行发酵共培养,通过无机盐去除实验优化初始培养基,通过
13、冻干保护剂筛选实验选出适合的保藏保护剂.研究可为开发适合水产养殖用复合益生菌制剂提供实验指导.1材料与方法1.1实验菌株枯草芽孢杆菌(YA)格式乳球菌(M4IY)施氏假单胞菌(JM)、酵母菌(Y),均由本实验室前期从水产动物半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)肠道中分离鉴定,-8 0 冰箱中保存.1.2实验试剂试剂:乙酸钠、蛋白陈、磷酸氢二钾,上海迈瑞尔化学技术有限公司;酵母粉、柠檬酸氢二铵,上海毕得医药科技股份有限公司;吐温8 0,天津歆毅翎科技有限公司;牛肉浸粉,天津市宝抵区军扬生物试剂销张晓月,等:复合益生菌发酵培养基与冻干保护剂的筛选水率.计算公式如下:吸水率(%)=
14、(m2-ml)/m100式中:m为吸水饱和后吸附剂的质量;mi为吸水前吸附剂的质量。33售中心;葡萄糖,天津市沃凯生物科技有限公司;硫酸镁、硫酸锰,天津凯玛特化工科技有限公司;TSB胰酪大豆陈液体培养基(HB4114-19)、YPD 液体培养基(H B5193-1)、M R S肉汤培养基(海博#HB0384-1),青岛海博生物技术有限公司.冻干保护剂:可溶性淀粉、甘油,上海迈瑞尔化学技术有限公司;脱脂奶粉,蒙牛乳业集团有限公司.初始培养基:葡萄糖2 0 g,蛋白陈10 g,牛肉浸粉5g,酵母粉5g,M g S0 40.1g,乙酸钠5g,柠檬酸氢二铵2 g,K,HP042g,M n S0 40.
15、0 5g,吐温8 0 1mL,蒸馏水10 0 0 mL,pH值为7.4.1.3菌种活化及扩大培养将4株益生菌由保藏状态恢复到室温状态,使用一次性接种环分别将枯草芽孢杆菌与施氏假单胞菌菌液涂布于固体TSB平板上,格氏乳球菌菌液涂布于MRS平板,酵母菌菌液涂布于YPD平板上.涂布后将平板置于培养箱中,2 8 条件下培养2 4h,待长出单菌落后,重复上述步骤,再次活化.1.4培养基优化(去除无机盐)以培养基中不去除任何无机盐为对照组,逐一去除初始培养基中的各种无机盐(硫酸镁、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、硫酸锰),其余成分保持不变,配制成液体培养基,调pH值到7.4,12 1条件下灭菌2 0 m
16、in.待培养基冷却后,将活化好的4株菌(1x10mL-),以2%的接种量同时接人到液体培养基中,各液体培养设置3个平行.置于摇床上,2 2 0 r/min、28培养15h(时间依据每株菌的生长曲线比对后确定).将菌株的共培养液梯度稀释后分别涂布于MRS、TSB、YPD 固体平板上,分别对4株菌进行平板计数.其中,枯草芽孢杆菌与施氏假单胞菌均涂布于TSB培养基上.依据菌落形态区分计数:枯草芽孢杆菌菌落为多边形,边缘毛糙不整齐;施氏假单胞菌菌落为白色圆形,表面光滑湿润,边缘整齐.1.5固定化吸附剂的选择1.5.1吸附剂吸水性的比较以稻壳粉、玉米芯粉、牡蛎壳粉和玉米粉4种粉末作为吸附剂,分别称取5g
17、,放人50 mL烧杯中,每种吸附剂设置3组平行,烧杯中加蒸馏水至吸附剂完全被水浸没,静置2 h后过滤去除多余水分.称量吸水饱和后吸附剂的质量,并计算出各种吸水材料的吸(1)341.5.2吸附剂对于4株菌吸附效果的比较对4株菌进行菌种活化,同时接种于共发酵培养基中进行混菌发酵.称取4种吸附剂各2 g于三角瓶中,向每个三角瓶中加人混菌发酵液2 0 mL,将其混匀.静置吸附30 min后取上清液,梯度稀释后涂平板菌落计数,分析4种吸附剂的吸附效果.1.6益生菌制剂的干燥采用低温真空冷冻干燥法对益生菌制剂进行干燥处理.将活化好的混菌转移到冻存管中,加人不同的保护剂混合均匀(设置3个平行),先在4条件下
18、预冷12h,然后转入-8 0 冰箱中冷冻2 4h,最后转人低温真空冷冻干燥机中处理2 6 h,得到冻干菌粉1.7真空冻干保护剂的筛选将活化好的混菌转移到冻存管中,每个冻存管中加人不同含量不同种类的冻干保护剂:甘油,体积分数分别为1%、2%、3%、4%、5%;脱脂奶粉,质量分数分别为4%、8%、12%、16%、2 0%;可溶性淀粉,质量分数分别为4%、8%、12%、16%、2 0%.每种保护剂的每个1009080(-TU,O1)/706050403020100对照组天津师范大学学报(自然科学版)含量设置3个平行,进行低温冷冻干燥.干燥后将冻干菌粉进行复水并稀释平板计数,对4株菌的存活率进行统计并
19、计算,计算公式如下:菌株存活率(%)=连存后的活菌数冻存前的活菌数2丝结果与分析2.1培养基优化(去除无机盐)为实现4株水产养殖用益生菌的共发酵培养并且保证每株菌的数量,需要找出能够使它们共同生长的培养基.根据4株益生菌单独培养时分别使用的培养基成分得出初始培养基成分,在利用该初始培养基进行混菌发酵时,发现枯草芽孢杆菌始终不生长.由于4株菌所使用的有机营养成分均相似,只有无机盐差别较大,推测可能是某种无机盐对枯草芽孢杆菌的生长有一定的影响,因此设计去除无机盐实验,分别统计去除某一种无机盐后4株益生菌的数量,结果如图1所示.3025(r-TuO1)/圈20*15105*0对照组除硫酸镁除硫酸锰2
20、023年11月x100(2)除乙酸钠除硫酸镁除硫酸锰除乙酸钠除磷酸氢二钾除柠檬酸氢二包去除无机盐种类(a)酵母菌3530(r-Tul,01)/豫开2520151050对照组除磷酸氢二钾除柠檬酸氢二包去除无机盐种类(b)施氏假单胞菌4.03.53.0(r-TU,01)/翼2.52.0F*1.5*1.00.5F0对照组除硫酸镁除硫酸锰除乙酸钠除硫酸镁除硫酸锰除乙酸钠除柠檬酸氢二镇去除无机盐种类除磷酸氢二钾除柠檬酸氢二饺去除无机盐种类除磷酸氢二钾(c)格氏乳球菌注:*,0.0 1 P0.05;*,P0.05);去除硫酸锰对酵母菌没有显著影响.由图1(b)可以看出,当分别去除柠檬酸氢二铵和硫酸锰时,施
21、氏假单胞菌的数量显著下降,生长受到限制,去除磷酸氢二钾和乙酸钠对施氏假单胞菌的数量没有显著影响,去除硫酸镁时酵母菌的数量增加.由图1(c)可以看出,培养基中分别去除柠檬酸氢二铵和硫酸锰时,格氏乳球菌的生长受到显著影响,而去除其他3种无30*25208/喜151050玉米芯粉注:*,P0.001.2.2.2以吸附剂对4株菌的吸附效果比较4种吸附剂对益生菌的吸附效果,结果如图3所示.由图3可以看出,4种吸附材料对不同菌株表现出不同的吸附能力.综合来看,牡蛎壳粉对酵母菌和格氏乳球菌的吸附效果最好,上清液中剩余的菌株浓度分别为3.9 510 7 mL-l和14.0 10 7 mL-l;对施氏假单胞菌和
22、枯草芽孢杆菌吸附效果较差,上清液中剩余的菌株浓度分别为7.7 7 10 7 mL-1和8.7 310 mL-l稻壳粉与牡蛎壳粉的吸附效果相似,对酵母菌和格氏乳球菌表现出较好的吸附效果,上清液中剩余菌株浓度分别为2.2 510 mL-l和1.7 110 mL-l;对枯草芽孢杆菌和施氏假单胞菌的吸附效果较差.比较4种吸附剂,玉米粉对4株菌都有较强的吸附性,上清液中菌体浓度总体上低于其他3种吸附剂,尤其对枯草芽孢杆菌和施氏假单胞菌有显著吸附效果,上清液中菌体剩余浓度分别为4.5310 mL-l和1.7 310 mL-.而玉米芯粉只对枯草芽孢杆菌表现出显著吸附效果,上清液中剩余菌株浓度为0.46 10
23、 mL-,对施氏假单张晓月,等:复合益生菌发酵培养基与冻干保护剂的筛选2.2.1吸附剂的吸水性选取4种常见吸附剂进行吸水性的比较,分别计算每种材料的吸水量和吸水率,结果如图2 所示.由图2 可以看出,玉米芯粉的吸水率最高,为5.30%;其次是稻壳粉,吸水率为1.6 9%,每5g的平均吸水量为8.44g;再次为玉米粉,吸水率为1.2 6%,每5g的平均吸水量为6.2 9g;牡蛎壳粉的吸水效果最差,吸水率为0.70%,每5g的平均吸水量为3.48 g.6*543210稻壳粉玉米粉牡蛎壳粉吸附剂(a)吸水量Fig.2Water absorption of different adsorbents35
24、机盐对其没有显著限制作用.由图1(d)可以看出,培养基中只有去除了乙酸钠枯草芽孢杆菌才能正常生长,因此乙酸钠是限制枯草芽孢杆菌生长的最主要因素.2.2固固定化吸附剂的选择稻壳粉玉米粉玉米芯粉牡蛎壳粉吸附剂(b)吸水率图2 不同吸附剂的吸水性胞菌、格氏乳球菌、酵母菌都表现出较差的吸附效果.因此最终将玉米粉确定为4株菌混合发酵制剂的固定化吸附剂.108(-TU)/燥6420牡蛎壳粉注:菌株Y和菌株M4II Y的含量均为纵坐标数值10%;菌株YA的含量为纵坐标数值10%;菌株JM的含量为纵坐标数值10.*,0.0 1 P0.05;*,P0.01.图3不同吸附剂对益生菌的吸附效果Fig.3 Adsor
25、ption effect of different adsorbents on fourprobiotic strainsYYAJMM4Y*稻壳粉玉米粉玉米芯粉吸附剂362.3真空冻干保护剂的筛选为了使益生菌制剂便于施用和保存,采用真空冷冻干燥技术,将混菌菌液干燥制成粉末制剂.在此过程中冻干保护剂的选择对最终制剂中菌种的活性至关重要,因此本研究对可溶性淀粉、甘油和脱脂奶粉这3种冻干保护剂的作用效果进行了比较,结果如图4所示.908070605040302010090807060%率5040302010090807060%/率专50403020100图4冻干保护剂对益生菌的保护效果Fig.4 P
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