复合益生菌对免疫低下模型小鼠的保护作用.pdf
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1、复合益生菌对免疫低下模型小鼠的保护作用李玟玟袁马微微袁马青袁张振华袁张丽欣袁黄莉莉*渊黑龙江中医药大学药学院哈尔滨 150040冤摘要为探讨复合益生菌对环磷酰胺诱导免疫低下模型小鼠免疫功能的影响袁 将 BALB/c 小鼠随机分为空白组和模型组渊灌胃生理盐水冤袁阳性对照组揖灌胃盐酸左旋咪唑渊10 mg/kg冤铱袁低尧中尧高剂量实验组渊分别灌胃 2.5伊106袁5伊106袁1伊107CFU/0.4 mL 复合益生菌冤袁持续实验 28 d袁测定小鼠脏器指数尧细胞免疫功能尧体液免疫功能尧脾淋巴细胞亚群百分比和血清免疫球蛋白及细胞因子水平遥 结果表明袁与模型组比较袁各剂量组小鼠胸腺指数明显增加渊P约0.
2、01冤袁低尧中尧高剂量实验组分别增加 58.92%袁67.86%袁80.36%曰迟发型变态反应程度增加渊P约0.01冤袁低尧中尧高剂量实验组分别增加 20.34%袁27.12%袁67.80%曰血清溶血素水平均增加渊P约0.05冤袁以中剂量和高剂量组增加显著渊P约0.01冤袁分别增加 31.25%袁40.23%曰低尧中尧高剂量实验组脾淋巴细胞 CD3+尧CD4垣CD8原和 CD4原CD8垣百分比增加渊P约0.05冤袁以 CD3+最为显著渊P约0.01冤袁低尧中尧高剂量实验组分别增加 33.17%袁42.63%袁54.65%曰高剂量组自然杀伤渊NK冤细胞比例明显增加 56.50%渊P约0.01冤袁
3、血清免疫球蛋白 IgA尧Ig郧尧IL-2尧TNF-琢 水平均升高渊P约0.05冤遥结论院复合益生菌对环磷酰胺诱导小鼠免疫力低下具有显著改善作用袁为增强免疫力作用的保健食品开发提供了参考依据遥关键词益生菌曰 环磷酰胺曰 免疫功能曰 淋巴细胞亚群曰 细胞因子文章编号1009-7848渊2023冤08-0124-08DOI院 10.16429/j.1009-7848.2023.08.0142019 年底新型冠状病毒肺炎渊COVID-19冤疫情在全球爆发袁在疫情影响下袁免疫系统是被广泛谈论的话题遥研究表明袁机体免疫功能下降是新冠肺炎发病的重要原因之一1遥 因此袁增强机体免疫力袁提高抗病毒能力袁避免自身
4、出现基础疾病尤为重要遥我国益生菌市场发展前景巨大袁益生菌具有增强机体免疫力的作用已被广泛认同袁 因其具有安全尧可靠尧性能优良等特点袁而在临床使用中受到越来越多的关注2-3遥 目前最常见的益生菌主要来自于双歧杆菌属渊Bifidobacterium冤和乳杆菌属渊Lactobacillus冤袁 其中乳双歧杆菌 XLTG11渊Bifi鄄dobacterium lactis XLTG11袁 B.lactis XLTG11冤尧植物乳杆菌 P8 渊Lactobacillus plantarum P8袁 L.casei P8冤尧干酪乳杆菌 Zhang渊Lactobacillus caseiZhang袁 L.c
5、asei Zhang冤 皆具有良好的耐酸性袁对人工胃液耐受性强袁 属国内外目前用于开发的具有增强机体免疫功能的重要乳杆菌属菌株4-6遥 研究表明袁乳双歧杆菌 V9尧干酪乳杆菌 Zhang尧植物乳杆菌 P8 组成的复合制剂可增强小鼠免疫功能7袁然而含有乳双歧杆菌 XLTG11尧干酪乳杆菌Zhang 和植物乳杆菌 P8 的复合益生菌制剂增强免疫功能的研究未见报道遥 本实验研究不同剂量的 复 合 益 生 菌 制 剂 对 环 磷 酰 胺 渊Cyclophos鄄phamide袁 CTX冤 诱导的小鼠免疫功能的影响袁为复合益生菌微生态制剂产品开发和应用提供科学依据遥1材料与方法1.1实验菌种复合益生菌制剂
6、袁 本实验所用益生菌制剂是乳双歧杆菌 XLTG11 渊1伊1011CFU冤尧 干酪乳杆菌Zhang 渊1伊1011CFU冤 和植物乳杆菌 P8 渊1伊1011CFU冤以 4颐3颐3 质量比复配混合制成袁由金华银河生物科技有限公司提供遥1.2实验动物SPF 级 BALB/c 小鼠袁68 周龄袁雄性袁体质量1822 g袁清洁级动物房中饲养袁温度 2023 益袁12h 明暗交替袁期间自由饮水尧摄食遥1.3试剂与仪器CTX 冻干粉袁江苏恒瑞医药股份有限公司曰盐酸左旋咪唑 渊Levamisole hydrochloride袁 LEV冤袁山西太原药业有限公司曰绵羊红细胞渊SRBC冤袁玉环收稿日期院 圆园圆
7、圆-08-10基金项目院 黑龙江省自然科学基金项目渊LH2019H106冤第一作者院 李玟玟袁女袁硕士通信作者院 黄莉莉E-mail院 灾燥造援 23 晕燥援 8Aug援 圆 园 2 3允燥怎则灶葬造 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 云燥燥凿 杂糟蚤藻灶糟藻 葬灶凿 栽藻糟澡灶燥造燥早赠中 国 食 品 学 报第 23 卷第 8 期圆 园 2 3 年 8 月第 23 卷 第 8 期市南方试剂有限公司曰 小鼠荧光单抗 CD3-FITC尧CD4-PE-Cy7尧CD8a-APC 和 NK-1.1-PE袁 安诺伦渊北京冤生物科技有限公司曰小鼠血清 ELISA 试剂盒 IgA尧IgG尧IL
8、-2尧IL-12袁IL-1茁尧TNF-琢袁江苏酶免实业有限公司遥游标卡尺渊精密度 0.02 mm冤袁哈尔滨量具刃具集团有限责任公司曰微量注射器渊50 滋L冤袁上海安亭微量进样器厂曰MLS-3751L-PC 高压蒸汽灭菌器尧MDF-382E-80 益冰箱袁 日本 Panasonic 公司曰SORVALL ST8/8R 低温离心机袁 美国 TOMOS 公司曰NovoCyte3110 流式细胞仪袁美国 Agilent 公司遥1.4实验方法1.4.1动物实验设计BALB/c 小鼠随机分为 6组袁空白组和模型组灌服生理盐水尧阳性对照组灌服 LEV 渊10 mg/kg冤尧 复合益生菌粉低 渊2.5伊106
9、CFU冤尧中渊5伊106CFU冤尧高渊1伊107CFU冤剂量组灌服益生菌制剂袁每组 8 只袁持续给予 28 d遥 参照文献8袁在处死前 6 d袁向模型组尧益生菌组和阳性对照组小鼠腹腔注射 CTX渊40 mg/kg冤袁连续 2 d袁空白组小鼠腹腔注射生理盐水袁 复制免疫功能低下小鼠模型遥1.4.2免疫器官指数测定实验第 28 天袁记录小鼠末次给药 30 min 后的体质量袁处死并在无菌环境下摘除胸腺和脾脏袁洗去血液袁沥干水分袁称重袁计算胸腺或脾脏质量渊mg冤与体质量渊g冤的比值遥1.4.3迟发型变态应测定 渊Delayed type hyper鄄sensitivity袁 DTH冤采用足跖增厚法测
10、定小鼠迟发型变态应程度遥 实验第 23 天袁每只小鼠腹腔注射 2%渊体积分数冤SRBC 0.2 mL 致敏遥 4 d 后袁对小鼠左后足趾厚度进行测量袁 并在测量部位皮下注射 20%渊体积分数冤SRBC袁每只小鼠 20 滋L渊约 1伊108个 SRBC冤袁 于 24 h 后再次对小鼠左后足趾部位厚度进行测量袁同一部位测量 3 次取平均值袁以注射前尧后的足趾厚度差值来表示 DTH 的反应程度遥1.4.4血清溶血素水平测定 渊血凝法冤实验第24 天袁 每只小鼠腹腔注射 0.2 mL 2%渊体积分数冤SRBC 进行免疫袁免疫后 45 d 眼球取血袁置于离心管内袁放置约 1 h袁将凝固血与管壁剥离袁使血
11、清充分析出袁2 000 r/min 离心 10 min袁收集血清遥 使用生理盐水将血清倍比稀释后转移至微量血凝板内袁再加入 0.5%渊体积分数冤SRBC 混匀袁37 益温箱孵育 3 h袁统计血球凝集度袁计算相应抗体积数遥1.4.5脾淋巴细胞亚群百分比检测实验第 28天袁小鼠末次给药 30 min 后处死袁无菌环境摘取脾脏并放入组织保存液中待用遥 将小鼠脾脏剪碎研磨过滤袁收集小鼠脾细胞袁加入 PBS袁重悬沉淀袁用 100 滋L PBS 重悬细胞沉淀后染色袁置于流式细胞管中遥 将 anti-CD3尧anti-CD4尧anti-CD8 和 anti-NK 抗体按稀释比例加入至细胞悬液中袁4 益避光孵
12、育 30 min袁洗涤后加入 500 滋L PBS 重悬细胞沉淀遥 结果以 CD3垣尧CD4垣CD8原尧CD4原CD8垣T 淋巴细胞和 NK 细胞的百分比表示复合益生菌对小鼠脾淋巴细胞亚群的影响遥1.4.6血清 IgA尧IgG尧IL-2尧IL-12尧TNF-琢 水平测定实验第 28 天袁小鼠末次给药 30 min 后袁眼球取血袁3 000 r/min 离心 10 min袁取血清待用遥 分别采用小鼠血清 IgA尧IgG尧IL-2尧IL-12尧IL-1茁尧TNF-琢 试剂盒检测袁操作步骤按说明书进行遥1.5统计学分析采用 SPSS 26.0 统计软件进行统计学分析袁实验数据以平均值依标准差渊x 軃
13、 依 s冤表示袁多组间样本采用单因素方差分析进行数据处理袁LSD 法进行两两比较袁P0.05 具有显著性差异遥2结果与分析2.1复合益生菌对小鼠免疫器官指数的影响胸腺指数和脾指数的高低可以间接反应机体整体免疫水平袁 在保健品免疫功能评价中具有重要意义9遥由表 1 可知袁与空白组比较袁模型组胸腺指数和脾指数具有显著性差异渊P0.01冤袁与模型组比较袁阳性对照组胸腺指数具明显增加渊P0.01冤袁复合益生菌低尧中尧高剂量组均明显增加渊P0.01冤袁其中高剂量组差异显著渊P0.001冤遥2.2复合益生菌对小鼠迟发型变态反应的影响SRBC 可刺激 T 淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞袁引起迟发型变态反应袁是细
14、胞免疫的体内检测法遥 由表 2 可知袁与空白组比较袁模型组足跖厚度明显降低渊P0.01冤袁与模型组比较袁阳性对照组足跖厚度显著增加渊P0.001冤袁复合益生菌低尧中尧高剂量组均显著增加渊P0.05冤遥复合益生菌对免疫低下模型小鼠的保护作用125中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期组别胸腺指数脾指数空白组1.49 依 0.363.89 依 0.57模型组0.56 依 0.20*3.21 依 0.44*阳性对照组0.88 依 0.22#3.55 依 0.52低剂量益生菌组0.89 依 0.23#3.28 依 0.12中剂量益生菌组0.94 依 0.15#3.49 依 0.40高剂量益生菌组
15、1.01 依 0.14#3.63 依 0.35表 1复合益生菌对 CTX 诱导小鼠胸腺和脾指数的影响渊x 軈 依 s袁n=8冤Table 1Effects of compound probiotics on thymusand spleen index in CTX induced mice 渊x 軃 依 s袁n=8冤注院*.P0.01袁*.P0.001袁 与空白组比较曰#.P0.05袁#.P0.01袁#.P0.001袁与模型组比较遥组别足跖厚度/mm血清溶血素渊抗体积数冤空白组0.72 依 0.11106.88 依 15.00模型组0.59 依 0.08*72.38 依 17.87*阳性对照
16、组0.82 依 0.13#96.50 依 13.35#低剂量益生菌组0.71 依 0.11#91.38 依 13.54#中剂量益生菌组0.75 依 0.09#95.00 依 16.02#高剂量益生菌组0.99 依 0.10#101.50 依 16.99#表 2复合益生菌对 CTX 诱导小鼠迟发型变态反应和血清溶血素的影响渊x 軈 依 s袁n=8冤Table 2 Effects of compound probiotics on DTH andserum hemolysin content in CTX induced mice 渊x 軃 依 s袁n=8冤注院*.P0.01袁*.P0.001袁与
17、空白组比较曰#.P0.05袁#.P0.01袁#.P0.001袁与模型组比较遥2.3复合益生菌对小鼠血清溶血素的影响腹腔注射 SRBC 后袁小鼠体内会产生溶血素袁溶血素可以凝集 SRBC袁以凝集程度检测溶血素水平袁反应体液免疫功能遥 由表 2 可知袁与空白组比较袁模型组抗体积数显著降低渊P0.001冤袁与模型组比较袁阳性对照组抗体积数明显增加渊P0.01冤袁复合益生菌低尧中尧高剂量组均显著增加渊P0.05冤遥2.4复合益生菌对小鼠脾淋巴细胞亚群百分比的影响由表 3 和图 1尧图 2 可知袁与空白组比较袁模型组脾淋巴细胞 CD3垣尧CD4垣CD8原尧CD4原CD8垣和 NK细胞百分比均降低渊P0.
18、05冤遥 与模型组比较袁阳性对照组脾淋巴细胞 CD3垣尧CD4垣CD8原尧CD4原CD8垣和NK 细胞百分比均增加渊P0.05冤袁复合益生菌低尧中尧高剂量组脾淋巴细胞 CD3垣尧CD4垣CD8原和 CD4原CD8垣百分比增加渊P0.05冤袁中剂量组和高剂量组差异显著渊P0.01冤袁高剂量组 NK 细胞百分比明显增加渊P0.01冤遥2.5复合益生菌对小鼠血清 IgA尧IgG尧IL-2尧IL-12尧TNF-琢 水平的影响由表 4 可知袁与空白组比较袁模型组血清 IgA尧IgG尧IL-2尧TNF-琢 水平均降低 渊P0.05冤袁IL-12 水平显著降低渊P0.001冤遥 与模型组比较袁阳性对照组血清
19、 IgA尧IL-2尧IL-12尧TNF-琢 水平均增加渊P0.05冤袁IgG 水平增加明显渊P0.01冤袁复合益生菌低剂量组 IgA尧IgG尧IL-2尧TNF-琢 水平增加渊P0.05冤袁复合益生菌中剂量组血清 IgA尧IL-2尧IL-12尧TNF-琢 水平增加渊P0.05冤袁IgG 水平增加显著渊P0.001冤袁复合益生菌高剂量组 IL-2尧IL-12 水平增加明显 渊P0.01冤袁IgA尧IgG尧TNF-琢 水平增加显著渊P0.001冤遥组别CD3垣TCD4垣CD8原CD4原CD8垣NK空白组41.97 依 6.5168.33 依 4.8224.98 依 4.1411.18 依 3.03模
20、型组32.02 依 4.25*64.48 依 3.20*20.26 依 2.62*7.08 依 1.49*阳性对照组40.64 依 8.30#71.65 依 1.79#23.67 依 2.52#10.18 依 3.85#低剂量益生菌组42.64 依 5.48#69.98 依 3.58#23.20 依 1.90#8.29 依 2.54中剂量益生菌组45.67 依 6.41#71.77 依 3.60#24.66 依 2.39#9.52 依 3.16高剂量益生菌组49.52 依 4.22#72.16 依 2.62#24.87 依 2.04#11.08 依 2.57#表 3CTX 诱导小鼠脾淋巴细胞亚
21、群百分比渊x 軈 依 s袁n=8冤Table 3Percentage of splenic lymphocyte subsets of CTX induced mice 渊x 軃 依 s袁n=8冤注院*.P0.05袁*.P0.01袁与空白组比较曰#.P0.05袁#.P0.01袁#.P0.001袁与模型组比较遥126第 23 卷 第 8 期渊a冤空白组渊b冤模型组渊c冤阳性对照组渊d冤低剂量益生菌组渊e冤中剂量益生菌组渊f冤高剂量益生菌组图 1CTX 诱导小鼠脾淋巴细胞 CD4垣CD8原尧CD4原CD8垣百分比Fig.1Percentage of splenic lymphocyte CD4垣C
22、D8原尧CD4原CD8垣of CTX induced mice渊a冤空白组渊b冤模型组渊c冤阳性对照组渊d冤低剂量益生菌组渊e冤中剂量益生菌组渊f冤高剂量益生菌组图 2CTX 诱导小鼠脾淋巴细胞 CD3垣和 NK 百分比Fig.2Percentage of splenic lymphocyte CD3垣and NK of CTX induced mice复合益生菌对免疫低下模型小鼠的保护作用127中 国 食 品 学 报圆园23 年第 8 期组别IgA/ng 窑 mL-1IgG/ng 窑 mL-1IL-2/ng 窑 L-1IL-12/ng 窑 L-1TNF-琢/ng 窑 L-1空白组37.55
23、依 7.48508.01 依 77.72445.99 依 75.273.06 依 1.14417.86 依 47.41模型组27.18 依 8.08*369.25 依 71.02*290.63 依 124.35*1.34 依 0.60*348.64 依 66.82*阳性对照组35.30 依 5.80#483.85 依 66.55#383.25 依 69.28#2.29 依 0.52#421.38 依 59.47#低剂量益生菌组34.45 依 4.84#474.48 依 68.10#381.58 依 83.19#1.95 依 0.44417.13 依 55.41#中剂量益生菌组37.25 依 3
24、.98#560.20 依 98.48#397.88 依 92.88#2.32 依 0.94#458.76 依 81.88#高剂量益生菌组44.05 依 9.04#636.83 依 112.15#410.15 依 65.53#2.81 依 1.13#522.78 依 82.00#表 4各组小鼠血清 IgA尧Ig郧尧IL-2尧IL-12尧TNF-琢 水平渊x 軈 依 s袁n=8冤Table 4Levels of serum IgA袁 IgG袁 IL-2袁 IL-12袁 TNF-琢 of mile in various groups 渊x 軃 依 s袁n=8冤注院*.P0.05袁*.P0.01袁*.
25、P0.001袁与空白组比较曰#.P0.05袁#.P0.01袁#.P0.001袁与模型组比较遥3结论与讨论益生菌是一种活性微生物制剂袁 对宿主肠内菌群生态平衡有益袁可以刺激宿主免疫系统袁增强宿主免疫应答反应袁 对人体健康水平提升极为重要10遥 每年全球益生菌市场规模以 15%20%的速度增长袁而我国处于野大健康冶时代袁益生菌产业发展更为迅速袁预计在 2022 年将达到空前的市场规模11遥 我国科学技术部在野十三五冶期间部署多项重点相关项目袁 加强益生菌的基础研究并促进产业化升级袁 其中学术研究领域的重点方向即益生菌与人体健康和疾病防治的关系等研究12遥 因此袁益生菌增强机体免疫力相关研究及其保健
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