腹膜透析滤出液中游离mtDNA 与腹膜透析患者腹腔微炎症的相关性分析.pdf
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1、中国血液净化2023年10月 第22卷 第10期 Chin J Blood Purif,October,2023,Vol.22,No.10 临床研究 腹膜透析滤出液中游离mtDNA与腹膜透析患者腹腔微炎症的相关性分析邱杰山1暨利军1王燕翔1王丹萍1陈静静1方燊燊1【摘要】目的探讨腹膜透析滤出液中游离线粒体 DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)与腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)患者腹膜及腹腔微炎症的相关性。方法收集行PD治疗的患者85例,分为A组(1.5%葡萄糖腹膜透析液治疗组)和B组高浓度(2袋以上2.5%或4.25%)葡萄糖腹膜透析液治疗组。检测血
2、生化指标,腹膜透析滤出液中白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)、肿瘤坏死因子(tu-mor necrosis factor-,TNF-)、白细胞介素1(interleukin 1,IL-1)及白细胞介素(inter-leukin 18,IL-18)及mtDNA。比较2组患者上述指标的差异;将mtDNA分别与临床参数做相关性分析;通过多元回归分析明确影响腹膜透析滤出液中mtDNA浓度的危险因素。结果 B组患者透析龄长于A组(t=-2.206,P=0.030),血白蛋白(Alb)低于 A 组(t=2.635,P=0.010),腹膜透析滤出液中 IL-6(t=-4.835,P0.00
3、1)、TNF-(t=-6.557,P0.001)、IL-1(t=-2.395,P=0.019)、IL-18(t=-2.318,P=0.023)及游离mtDNA(t=-3.920,P0.001)均高于A组。腹膜透析滤出液中mtDNA与IL-6(r=0.721,P0.001)、TNF-(r=0.418,P0.001)、IL-1(r=0.771,P0.001)、IL-18(r=0.634,P0.001)及透析龄(r=0.240,P=0.030)均呈正相关,与Alb呈负相关(r=-0.319,P=0.003)。多元回归分析显示腹膜透析液中葡萄糖浓度升高(=0.358,P=0.005)、长透析龄(=0.
4、292,P0.001)及Alb降低(=-0.272,P=0.027)是腹膜透析滤出液中mtDNA水平升高的危险因素。结论腹膜透析滤出液中mtDNA与PD患者腹膜及腹腔慢性微炎症状态相关。高浓度葡萄糖腹膜透析液、长透析龄及低蛋白血症是导致其水平升高的危险因素。【关键词】腹膜透析;腹膜透析滤出液;线粒体DNA;微炎症中图分类号:R459.5文献标识码:Adoi:10.3969/j.issn.1671-4091.2023.10.005The correlation between free mtDNA in outflow dialysate and peritoneal micro-inflamm
5、ation in pa-tients undergoing peritoneal dialysisQIU Jie-shan1,JI Li-jun1,WANG Yan-xiang1,WANG Dan-ping1,CHEN Jing-jing1,FANG Shen-shen11Department of Nephrology,Xianju People s Hospital(Southeast Dis-trict of Zhejiang Provincial Peoples Hospital),Xianju 317300,ChinaCorresponding author:QIU Jie-shan
6、,Email:【Abstract】Objective To investigate the relationship between free mitochondrial DNA(mtDNA)levelin outflow dialysate and chronic peritoneum inflammation in patients undergoing peritoneal dialysis(PD).Methods A total of 85 patients with PD for more than 6 months were enrolled and divided into gr
7、oup A(us-ing dialysate with 1.5%glucose)and group B(using dialysate with 2.5%or 4.25%glucose more than twice aday).Blood samples were collected and serum biochemical parameters were tested.The outflow dialysate wascollected to measure interleukin-6(IL-6),tumor necrosis factor-(TNF-),interleukin-1(IL
8、-1),interleukin-18(IL-18)and free mtDNA in the fluid.The differences of these parameters were compared between the twogroups.The correlation between mtDNA in outflow dialysate and clinical parameters was analyzed.Multivari-ate regression was used to define the risk factors for mtDNA in dialysate.Res
9、ults PD duration was longer(t=-2.206,P=0.030)and serum albumin was lower(t=2.635,P=0.010)in group B than in group A.IL-6,TNF-,IL-1,IL-18 and free mtDNA in the dialysate were significantly higher in group B than in group A(t=-4.835,-6.557,-2.395,-2.318 and-3.920 respectively;P0.001,0.001,=0.019,=0.02
10、3 and 0.001 respec-tively).Free mtDNA level in the dialysate was positively correlated with the levels of IL-6,TNF-,IL-1 andIL-18 in dialysate and PD duration(r=0.721,0.418,0.771,0.634 and 0.240 respectively;P0.001,0.001,0.001 and=0.03 respectively),and was negatively correlated with serumAlb(r=-0.3
11、19,P0.01).Multivari-基金项目:浙江省中医药科技计划项目(2023ZL793);仙居县人民医院青年创新人才支持计划(21yja02)作者单位:317300 仙居,1仙居县人民医院(浙江省人民医院浙东南院区)肾脏内科通讯作者:邱杰山 317300 仙居,1仙居县人民医院(浙江省人民医院浙东南院区)肾脏内科Email: 739中国血液净化2023年10月 第22卷 第10期 Chin J Blood Purif,October,2023,Vol.22,No.10ate linear regression showed that higher glucose concentrati
12、on in dialysate(=0.358,P=0.005),longer PD du-ration(=0.292,P=0.000)and lower serum Alb concentration(=-0.272,P=0.027)were the risk factors forhigher free mtDNA in outflow dialysate.Conclusion Elevated mtDNA in outflow dialysate is associatedwith chronic micro-inflammatory status of the peritoneum in
13、 PD patients.Higher glucose concentration in di-alysate,longer PD duration and lower serum Alb concentration are the risk factors for higher free mtDNA inoutflow dialysate.【Key words】Peritoneal dialysis;Outflow dialysate;Mitochondrial DNA;Micro-inflammation腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)患者的腹膜组织由于长期暴露在高
14、浓度葡萄糖腹膜透析液(peritoneal dialysis fluid,PDF)中使氧化应激产 物、糖 基 化 终 产 物(advanced glycosylationend products,AGEs)及炎性介质等持续刺激腹膜组织而导致腹膜慢性炎性损伤1,2。其中AGEs诱导的炎症介质及氧化应激产物在此过程中起到了重要的作用3。AGEs可通过诱导线粒体氧化应激损伤而释放线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA),而mtD-NA的特定基序可作为病原体相关分子模式(patho-gen associated molecular patterns,PAMPs)与TOLL 样受体
15、 9(toll like receptor 9,TLR9)识别并激活固有免疫应答,导致肿瘤坏死因子-(tu-mor necrosis factor-,TNF-)及白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)的表达上调,从而放大炎症并加重细胞损伤4。此外,mtDNA还可通过直接及间接方式触发Nod样受体蛋白3(nod like receptorprotein 3,NLRP3)炎性小体活化,使白细胞介素-1(interleukin 1,IL-1)及白细胞介素 18(interleukin 18,IL-18)的表达上调5。研究显示6PD患者腹膜及腹腔慢性炎症与患者腹膜纤维化相关,但其相关机制
16、尚不完全清楚。游离mtDNA具有更强的致炎性5,且其可能是PD患者腹膜慢性炎症损伤的重要始动因素,但二者的关系尚不明确,本研究旨在探讨腹膜透析滤出液中游离mtDNA浓度与PD患者腹膜及腹腔微炎症状态的相关性及可能的分子机制。1研究对象与方法1.1 研究对象收集2022年1月2023年1月在仙居县人民医院肾内科行腹膜平衡试验的持续非卧床腹膜透析(continuous ambulatory peritoneal dialysis,CAPD)患 者 85 例。纳 入 标 准:年 龄 18 岁;CAPD治疗12月并定期随访;每日PDF交换35次,每日透析剂量为610 L;现有的透析治疗方案已持续1月。
17、排除标准:1月内有急性局部或全身严重感染;服用激素、免疫抑制剂或血管活性药物;合并血液系统肿瘤及其他实体器官肿瘤;合并自身免疫性疾病如系统性红斑狼疮、克罗恩病、系统性血管炎、类风湿性关节炎等;肝功能不全(丙氨酸氨基转移酶大于正常上限2倍)及肝硬化;合并严重心脑血管疾病。本研究经浙江省仙居县人民医院伦理委员会审核批准(仙医伦审2022研第071号)。1.2方法1.2.1一般资料患者来院行腹膜平衡试验(peritonealequilibration test,PET)时收集患者信息并留取空腹血标本,检测血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、血尿酸(UA)、血白蛋白(Alb)、血红蛋白(Hb)及C反应
18、蛋白(CRP)。在PET 4小时时留取患者腹膜透析滤出液标本,检测IL-6、TNF-、IL-1、IL-18及游离mtDNA。根据文献7计算残余肾功能(resid-ual renal function,RRF)。RRF(ml/min)=(尿液尿素氮浓度/血清尿素氮浓度)24h 尿量/1440+(尿 液 肌 酐 浓 度/血 清 肌 酐 浓 度)24h 尿 量/1440)/2。1.2.2分组根据患者既有的PD治疗方案,分为:A组:每日常规34袋1.5%葡萄糖乳酸钠PDF治疗方案;B组:每日至少需使用2袋以上2.5%的PDF或需使用4.25%的PDF。1.2.3一般指标检测采用日立7600全自动生化仪
19、(日立株式会社,日本)检测Scr、BUN、Alb及CRP。Sysmex XS-800i全自动血液分析仪(日本希森美康公司,日本)检测Hb。酶联免疫吸附(ELISA)法检测腹膜透析滤出液中 IL-6、TNF-、IL-1 及 IL-18(Solarbio,美国),具体操作方法严格按照试剂盒说明书进行,ELISA检测采用复孔,重复2次后取平均值,以减少误差。1.2.4实时定量PCR法检测腹膜透析滤出液中游离mtDNA参照文献8腹膜透析滤出液20 ml,以1500 g离心10分钟,取上清液200 ul,使用QIAamp DNA试剂盒提取无细胞DNA。通过扩增线粒体细胞色素B(cy-tochrome B
20、,Cyto B)基因的高度保守区来量化mtD-NA 拷贝数。Cyto B 的正向引物序列为 5-AT-740中国血液净化2023年10月 第22卷 第10期 Chin J Blood Purif,October,2023,Vol.22,No.10GACCCCAATACGCAAAAT-3,反 向 引 物 序 列 为 5-CGAAGTTTCATCATGCGGAG-3。PCR 引物和 TaqMan 酶由擎科生物科技(北京擎科生物科技有限公司,中国)设计和合成。含mtDNA基因片段的已知质粒用灭菌去离子水10倍稀释为标准品,标准品经10倍浓度梯度稀释至8个浓度,用实时荧光定量 PCR法测定,制备标准曲
21、线,根据建立的标准曲线计算mtDNA拷贝数,以拷贝数/ul表示,检测数据重复2次,取平均值。1.3统计学分析采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。符合正态分布的计量数据用(xs)表示,组间比较采用独立样本t检验;计数资料以n(%)表示,组间比较采用c2检验;两因素相关性分析采用Pearson相关分析法;多元回归分析采用Stepwise回归模型,选入标准为P0.05,剔除标准为P0.10。以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.12组患者一般情况、腹膜透析滤出液中炎性介质及游离mtDNA的比较2组患者在性别、年龄、Scr、BUN、UA、Hb、CRP及糖尿病病史等方面均无统计学差异。B组患者
22、透析龄长于A组,血Alb及RRF低于A组,腹膜透析滤出液中IL-6、TNF-、IL-1、IL-18及游离mtDNA均高于A组患者,详见表1。2.2腹膜透析滤出液中游离mtDNA与Alb、透析龄、IL-6、TNF-、IL-1、及IL-18的相关性分析相关性分析显示腹膜透析滤出液中mtDNA与血浆白蛋白呈负相关,与透析龄、IL-6、TNF-、IL-1及IL-18均呈正相关,详见表2。2.3影响腹膜透析滤出液中mtDNA水平的多元回归分析多元回归分析结果显示PDF中葡萄糖浓度升高、长透析龄及低蛋白血症是PD患者腹膜透析滤出液中mtDNA水平升高的危险因素,详见表3。3讨论mtDNA来源于祖先细菌基因
23、组,不同细胞类型的mtDNA拷贝数不同9。学者已在不同的生物流体中观察到mtDNA的存在,包括血浆、血清、脑脊液及分泌物等,且其可作为炎症的潜在生物标记和死亡率的预测因子10,11。研究发现只有游离的mtDNA能够引起机体炎性反应12。而炎症及氧化应激反应可使细胞线粒体受损或细胞死亡,从而使mtDNA释放入细胞外液13。与核DNA相比,mtDNA特别容易受表1A组与B组患者一般情况、腹膜透析滤出液中炎性介质及游离mtDNA的比较组别性别年龄透析龄RRF伴糖尿病Scr男,n(%)岁,(xs)月,(xs)ml/min,(xs)n(%)mol/l,(xs)A组(n=54)30(55.556)58.9
24、0711.65018.25911.5962.4441.58616(29.630)761.704252.131B组(n=31)18(58.065)62.6457.49524.45213.8492.0210.6207(22.581)690.973228.515t/c2值0.049-1.797-2.2061.4200.5031.287P值0.8170.0760.0300.0210.3320.202组别BUNUAAlbHbCRPmmol/l,(xs)mol/l,(xs)g/L,(xs)g/L,(xs)mg/L,(xs)A组(n=54)22.5278.988408.75672.47136.1045.55
25、7101.41113.9674.9834.113B组(n=31)26.0736.872387.711130.35433.3194.108100.26612.0444.1502.462t/c2值-1.8990.8272.6350.3831.168P值0.0610.4130.0100.7020.246组别MtDNA104拷贝/l,IL-6IL-1IL-18TNF-(xs)pg/ml,(xs)pg/ml,(xs)pg/ml,(xs)pg/ml,(xs)A组(n=54)0.4450.15023.9633.26326.6506.014134.35718.13321.6392.408B组(n=31)0.5
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