广西猪瘟病毒变异株分离鉴定及其E2基因遗传特性分析.pdf
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1、5期1539广西猪瘟病毒变异株分离鉴定及其E2基因遗传特性分析高跃美1,梁晶晶1,王文锋1,唐紫燕1,陈俊蓉1,周桂全1,蓝常力2,刘芳1,罗廷荣1*,李晓宁1*(1广西大学动物科学技术学院/亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,广西南宁530004;2广西桂垦龙北牧业有限公司,广西崇左532200)摘要:【目的】明确猪瘟病毒(CSFV)广西分离株的分子流行病学特点和病原学特性,为科学使用CSF疫苗及有效防控广西CSFV流行提供参考依据。【方法】2019年12月2020年10月,从广西南宁、隆安、柳州、百色及北海等地采集疑似CSFV感染的流产胎儿、死胎、木乃伊胎和弱仔猪的组织(心脏、肝脏
2、、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结等)进行CSFV检测,通过PK-15细胞进行病毒分离,采用RT-PCR和间接免疫荧光试验(IFA)进行鉴定,克隆CSFV分离株E2基因,经DNASTAR进行核苷酸序列及推导氨基酸序列同源比对分析后以MEGA 6.0构建遗传进化树;同时以Shimen标准株为对照,检测感染PK-15细胞后分离株的生长曲线、病毒mRNA和E2蛋白水平。【结果】从104份疑似CSFV感染样品中分离出1株CSFV,命名为GXNN2019-13,接种至PK-15细胞后并未出现细胞病变。GXNN2019-13株与我国Shimen标准株(强毒)和HCLV株(弱毒)的E2基因核苷酸序列相似性较低,分别
3、为84.6%和83.5%,而与日本CSF0745株及德国CSF0496和Alfort Tuebingen株的相似性分别为93.9%、92.2%和91.5%;GXNN2019-13株与Shimen和HCLV株的E2氨基酸序列相似性分别为89.3%和88.7%,与日本CSF0745株及德国CSF0496和Alfort Tuebingen株的相似性分别为95.5%、94.6%和93.8%;以HCLV株为参照进行多序列比对,发现GXNN2019-13株E2蛋白较Shimen标准株的变异程度更高。感染PK-15细胞后,GXNN2019-13株的病毒复制能力弱于Shimen标准株,生长曲线上各时间点的病毒
4、效价及mRNA水平均低于Shimen标准株。【结论】从疑似CSFV感染病料分离获得的GXNN2019-13株属于2.3亚型中的独立小分支,与之前的广西分离株亲缘关系较远,可能是新的变异毒株,其复制能力弱于Shimen标准强毒株。关键词:猪瘟病毒(CSFV);E2基因;分离鉴定;序列分析;2.3亚型中图分类号:S852.651文献标志码:A文章编号:2095-1191(2023)05-1539-10收稿日期:2022-06-22基金项目:国家重点研发计划项目(2018YFD0500104);广西自然科学基金项目(2018GXNSFBA281170,2021GXNSFAA220007)通讯作者:罗
5、廷荣(1962-),https:/orcid.org/0000-0002-0126-7394,博士,教授,博士生导师,主要从事动物病毒学研究工作,E-mail:;李晓宁(1980-),https:/orcid.org/0000-0003-2731-7537,博士,主要从事动物病毒学研究工作,E-mail:第一作者:高跃美(1995-),https:/orcid.org/0000-0002-1208-1288,研究方向为动物传染病防治与分子病毒学,E-mail:南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023,54(5):1539-1548ISSN 2095-1
6、191;CODEN NNXAABhttp:/DOI:10.3969/j.issn.2095-1191.2023.05.026Isolation and identification of mutant isolate of classical swinefever virus from Guangxi and genetic characteristicanalysis of E2 geneGAO Yue-mei1,LIANG Jing-jing1,WANG Wen-feng1,TANG Zi-yan1,CHEN Jun-rong1,ZHOU Gui-quan1,LAN Chang-li2,L
7、IU Fang1,LUO Ting-rong1*,LI Xiao-ning1*(1College ofAnimal Science and Veterinary Medicine,Guangxi University/State Key Laboratory for Conservation andUtilization of SubtropicalAgro-bioresources,Nanning,Guangxi 530004,China;2Guangxi GuikenlongbeiAnimalHusbandry Co.,Ltd.,Chongzuo,Guangxi 532200,China)
8、Abstract:【Objective】This study clarified the molecular epidemiological and etiological characteristics of theGuangxi isolates of classic swine fever virus(CSFV),to provide reference for the scientific use of the CSF vaccine andeffective prevention and control of the CSFV epidemic in Guangxi.【Method】
9、From December 2019 to October 2020,tis-54卷南 方 农 业 学 报 15400引言【研究意义】猪瘟(Classical swine fever,CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起猪的一种高度传染性和致死性疾病(Dahle and Liess,1992;吴其彪等,2011)。CSFV属于黄病毒科(Flavi-viridae)瘟病毒属(Pestivirus)的单股正链RNA病毒,主要由4种结构蛋白(Core、Erns、E1和E2)及8种非结构蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、N
10、S5A和NS5B)构成(Oude Ophuis et al.,2006)。基于NS5B和E2的核苷酸片段可精确区别CSFV基因型(Patonet al.,2000),故常用于CSFV的分子流行病学调查。E2基因被认为是CSFV的主要免疫原性结构基因(Knig et al.,1995;陆增荣等,2012),是CSFV遗传变异研究的重要序列片段(王丽等,2021)。因此,基于E2基因遗传特性分析CSFV在广西地区的流行特点,明确CSFV广西株的分子流行病学规律,可为科学防控CSF暴发流行提供理论参考。【前人研究进展】19世纪上半叶,美国有10个州报告了CSF暴发流行,1860年后CSFV在美国领土
11、上迅速传播,可能与铁路的快速发展有关(Edwards et al.,2000)。欧洲有关CSF的可靠报告可追溯到1862年的英国,随后CSFV传播扩散到瑞典、法国和丹麦。至20世纪60年代,CSFV在世界范围内已普遍存在。在基因组水平上,CSFV分为3个基因型(1、2和3),每个基因型又被细分为3或4个亚型(1.11.4、2.12.3和3.13.4)(Lowings et al.,1996;Paton et al.,2000);随着研究的不断深入,2.1亚型又被划分为2.1a2.1j等10个亚型(Gong et al.,2016)。在毒力水平上,CSFV可分为高毒力、中等毒力及低毒力或无毒力3
12、种类型(Pa-ton et al.,2000;Deng et al.,2005;Postel et al.,2013)。据报道,基因型与毒力间虽然没有明确的相关性(Beer et al.,2015),但大多数高毒力毒株是在基因型1中发现,如Shimen和Koslov等毒株(Lowings etal.,1996),基因型2和基因型3的毒株通常表现为中等毒力或低毒力(Leifer et al.,2011)。自20世纪80年代以来,全球流行的CSFV一直以基因型2为主,尤其是2.1亚型和2.3亚型(Paton et al.,2000)。根据E2基因序列,我国流行的CSFV大致可分为4个亚型(1.1、
13、2.1、2.2和2.3)(Tu et al.,2001),在过去10年间我国的CSFV流行毒株主要是2.1b亚型(蓝睿等,2020)。广西的CSFV流行较复杂,出现过的亚型有2.1a、2.1b和2.1c(孙石静等,2004;廖素环等,2005;Luo et al.,2011;龚文杰等,2016)。刘畅等(2020)还成功分离到2.1d亚型的广西株,在广西地区仍不时暴发小规模的CSFV流行感染,且与传统流行株存在一定差异,给传统的CSF疫苗带来巨大挑战。【本研究切入点】CSFV不仅通过胎盘垂直传播给胎儿,还能在胎儿与胎儿间发生水平传播,即CSFV感染母猪产下的存活仔猪会先天带毒,成为CSFV的传
14、染源。近年来,广西生猪的CSFV感染率有明显上升趋势,sues(hearts,livers,spleens,lungs,kidneys,lymph nodes)of aborted fetuses,stillbirths,mummified fetuses,andweak piglets suspected of CSFV infection were collected from Nanning,Long an,Liuzhou,Baise and Beihai in Guangxifor CSFV testing.The virus was isolated through PK-15 ce
15、lls,and identified by RT-PCR and indirect immunofluorescencetests(IFA).The E2 gene of the CSFV isolates was cloned.The nucleotide sequence and deduced amino acid sequencewere derived via DNASTAR to conduct homology comparison and analysis and the genetic evolutionary tree was con-structed with MEGA
16、6.0.At the same time,with the Shimen standard strain as a control,the growth curve,virus mRNA,and E2 protein levels of the isolates after infecting PK-15 cells were tested separately.【Result】A strain of CSFV was iso-lated from 104 suspected CSFV-infected samples and named GXNN2019-13.There was no cy
17、topathy after inoculationwith PK-15 cells.The similarity of E2 gene nucleotide sequence between the GXNN2019-13 strain and the standard Shi-men strain(strong toxic)as well as the HCLV strain(weak toxic)in China was low,which was 84.6%and 83.5%respec-tively.The similarity of E2 gene nucleotide sequen
18、ce between the GXNN2019-13 strain and the Japanese CSF0745 strain,the German CSF0496 and the Alfort Tuebingen strains was 93.9%,92.2%,and 91.5%respectively.The similarity of E2amino acid sequence between the GXNN2019-13 strain and Shimen as well as HCLV strain was 89.3%and 88.7%respec-tively.The sim
19、ilarity between the GXNN2019-13 strain and the Japanese CSF0745 strain,the German CSF0496 andAlfort Tuebingen strains was 95.5%,94.6%,and 93.8%respectively.Taking the HCLV strain as a reference for multiplesequence comparison,it was found that the E2 protein in the GXNN 2019-13 strain had a higher d
20、egree of variation thanthat ofthe Shimen standard strain.Infected with PK-15 cells,the virus replication ability of the GXNN2019-13 strain wasweaker than that of the Shimen standard strain,and the viral titer and mRNA levels at various time points in the growthcurve were lower than that of the Shime
21、n standard strain.【Conclusion】The GXNN2019-13 strain obtained from suspectedCSFV-infected material is an independent small branch of subtype 2.3.It is far from related to the previous Guangxiisolates,which may be a new mutated strain with weaker replication ability than that of the Shimen standard s
22、train(strong toxic).Key words:classical swine fever virus(CSFV);E2 gene;isolation and identification;sequence analysis;2.3 subtypeFoundation items:National Key Research and Development Program of China(2018YFD0500104);Guangxi Natu-ral Science Foundation(2018GXNSFBA281170,2021GXNSFAA220007)5期1541因此亟待
23、通过病原学监测掌握CSFV广西株的流行特点及病原特性,为有效预警及防控CSF提供理论依据。【拟解决的关键问题】采集广西各地疑似CSF病例的流产胎儿、死胎、木乃伊胎和弱仔猪的组织样品进行CSFV分离鉴定,并对其E2基因进行克隆与测序分析,明确CSFV广西流行株的病原学特性,为科学使用CSF疫苗及有效防控广西CSFV流行提供参考依据。1材料与方法1.1试验材料抗CSFV E2蛋白单克隆抗体购自金诺生物科技有限公司;-Actin抗体和马抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;病毒DNA/RNA抽提取试剂盒AxyPrepTMBody Fluid Viral DNA/RNA Miniprep购自美
24、国Axygen公司;胶回收试剂盒、总RNA提试剂盒及大肠杆菌TOP10感受态细胞购自天根生化科技(北京)有限公司;免疫荧光染色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;胎牛血清和DMEM培养基购自Gibco公司;PrimeSTAR Max、dNTPs、M-MuLV反转录酶、RNasin及pMD18-T载体购自TaKaRa公司;猪肾细胞(PK-15)系和CSFV Shimen标准株由亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室保存提供。1.2样品采集2019年12月2020年10月,从广西南宁、隆安、柳州、百色及北海等地采集疑似CSFV感染的104头仔猪(包括流产胎儿、死胎、木乃伊胎及3周龄左右的弱仔
25、猪)的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结等组织样品,采集的组织样品经RT-PCR检测,选取CSFV阳性样品进行病毒分离与鉴定。1.3引物设计与合成根据CSFV的NS3基因高度保守区设计病料检测引物(袁朝霞等,2008),同时根据NCBI已收录的CSFV HCLV株基因序列(AF531433.1)设计扩增E2基因的特异性引物,所有引物委托北京六合华大基因科技有限公司合成,引物序列信息见表1。1.4样品处理取疑似CSFV感染仔猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结等组织样品约1.0 g,置于装有5 mm钢珠的高压灭菌EP管(2 mL)中,加入PBS制成10倍稀释乳剂。乳剂冻融3次后置于-80
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- 关 键 词:
- 广西 猪瘟 病毒 变异 分离 鉴定 及其 E2 基因 遗传 特性 分析