基于WGCNA的谷子苗期冷胁迫应答基因网络构建与核心因子发掘.pdf
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1、中国农业科技导报,2023,25(10):22-34Journal of Agricultural Science and Technology基于WGCNA的谷子苗期冷胁迫应答基因网络构建与核心因子发掘张会1,2,王越越2,3,赵波2,3,张丽玲3,郄倩茹3,韩渊怀2,3,李旭凯1,2*(1.山西农业大学生命科学学院,山西 太谷 030801;2.山西农业大学山西省后稷实验室,太原 030031;3.山西农业大学农学院,山西 太谷 030801)摘要:研究植物响应低温胁迫的分子基础及选育与种植耐冷作物品种对于保障粮食安全具有重要的现实意义,但目前谷子(Setaria italica)耐冷相关
2、研究比较匮乏。为深入研究谷子苗期响应低温胁迫的分子机制,利用谷子33份不同发育阶段和不同冷处理时间的RNA-Seq数据,筛选获得32 017个高表达基因并构建基因表达矩阵。利用R软件的WGCNA包构建共表达网络,进一步将网络划分为44个模块,发现谷子冷胁迫应答基因分布于多个模块中。选取包含冷胁迫基因数目排名前3的模块进一步分析,对预测到的靶基因进行GO富集分析,并对此3个模块进行基因调控网络的构建及核心基因注释,发现大多候选基因与非生物胁迫响应相关。以上结果为谷子抗逆研究提供了新思路,发掘的冷胁迫关键基因为谷子耐冷新品种选育提供了基因资源。关键词:谷子;冷胁迫;加权基因共表达网络doi:10.
3、13304/j.nykjdb.2023.0108 中图分类号:S515文献标志码:A文章编号:10080864(2023)10002213Identification of Co-expression Genes Related to Cold Stress in Foxtail Millet by WGCNAZHANG Hui1,2,WANG Yueyue2,3,ZHAO Bo2,3,ZHANG Liling3,QIE Qianru3,HAN Yuanhuai2,3,LI Xukai1,2*(1.College of Life Sciences,Shanxi Agricultural Uni
4、versity,Shanxi Taigu 030801,China;2.Houji Laboratory in Shanxi Province,Shanxi Agricultural University,Taiyuan 030031,China;3.College of Agriculture,Shanxi Agricultural University,Shanxi Taigu 030801,China)Abstract:It is of great practical significance to study the molecular basis of plant response
5、to low temperature stress and breed new varieties of cold-tolerant for ensuring food security.However,the study is relatively scarce about cold resistance of foxtail millet(Setaria italica).To further explore the molecular mechanism of millet responsing to low temperature stress at seedling,33 RNA-S
6、eq data of foxtail millet at different development stages and different cold stress times were used.Gene expression matrix was constructed using 32 017 highly expressed genes.WGCNA package of R software was used to construct a co-expression network,which was further divided into 44 modules.The genes
7、 related to cold stress of foxtail millet were existed in several modules.Here,3 modules with most cold stress genes were selected for GO enrichment analysis to annotate the function of target genes,and it was found that most candidate genes were related to abiotic stress responses.Above results pro
8、vided new ideas for stress resistance of foxtail millet,and the key genes of cold stress provided effective resources for breeding the new variety of cold tolerance in foxtail millet.Key words:foxtail millet;cold stress;weighted gene co-expression network收稿日期:20230217;接受日期:20230614基金项目:杂粮种质资源创新与分子育种
9、国家实验室(筹)自主研发项目(202204010910001-02);山西省基础研究计划(自由探索类)青年项目(202203021222147);山西省博士毕业生、博士后研究人员来晋工作奖励经费科研项目(SXBYKY2022059);山西农业大学博士科研启动项目(2021BQ112);国家自然科学基金项目(32001608,32301778)。联系方式:张会 E-mail:;*通信作者 李旭凯 E-mail:xukai_10 期张会等:基于WGCNA的谷子苗期冷胁迫应答基因网络构建与核心因子发掘谷子(Setaria italica)古称稷、粟、粱,是起源于我国黄河流域的古老作物,一万多年前由青
10、狗尾草(Setaria viridis)驯化而来1。谷子是二倍体(2n=2X=18),基因组较小(约440 Mb)2-4,具有耐旱、耐贫瘠、适应性强等特点,被誉为“五谷之首”,与C3模式作物水稻(Oryza sativa)“优势互补”“水旱对照”“南北呼应”,成为旱生C4禾谷类作物分子育种研究的模式植物5。本实验室通过对 晋谷21 进行EMS(ethylmethane sulfonate)诱变获得矮秆超早熟突变体材料xiaomi,xiaomi生育期短,约60 d,其全基因组测序的完成为本研究奠定了基础4。植物生存缺乏自主移动性,易遭受低温、干旱、盐碱等非生物胁迫,严重影响植物的生长发育6。低温
11、胁迫对作物整个生育过程都会造成不同程度的影响,如种子萌发、植株生长发育、产量和品质形成等7。近年来,国内外多个研究团队在水稻耐冷相关的数量性状位点(quantitative trait locus,QTL)克隆与调控机制解析等方面取得了一定进展8。水稻低温感受器基因COLD1编码膜定位蛋白,可与 G蛋白 亚基 RGA1互作以感知低温,激活 Ca2+通道,并增强 G 蛋白 GTP 酶活性;COLD1能够正向调控下游转录因子OsDREB1B和OsDREB1C的表达,并偶联叶绿体中的维生素E维生素 K1代谢调控网络,进而调控水稻的耐冷性910。Ca2+作为第二信使,在冷信号的激活和转导中发挥重要作用
12、。研究发现,过表达膜定位的钙通道蛋白OsCNGC9可以增强水稻幼苗的耐冷 性:在 转 录 水 平,OsCNGC9 受 转 录 因 子OsDREB1A的直接转录激活调控;在蛋白水平,激酶 OsSAPK8 可与 OsCNGC9 互作并使其磷酸化,进而激活 Ca2+的内流11;AP2 转录因子家族的CBF/DREBs转录因子在单、双子叶植物中高度保守,可以促进多个冷相关基因(COR)的表达,增强植株的耐冷性12。此外,OsWKRY71/94/45/76、OsMYB3R-2/30、OsTCP-5/6/8/21、OsbZIP38/52/71/73、OsSPL3/14/17、OsMADS57和OsSLR1
13、等转录因子基因均直接参与水稻的低温胁迫调控13。玉米中也有较多耐冷相关 QTL定位和候选基因预测的报道,但克隆的基因较少14。谷子中耐冷基因定位及克隆的研究较为匮乏。因此,挖掘谷子中的耐冷基因有助于进一步探索谷子的抗逆机理,阐明其分子遗传机制,有助于推进谷子耐冷遗传改良进程。加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)是在鉴定出表达模式相似的基因集合(module)的基础上,解析不同基因集合与不同分组样品表型之间的关联性,绘制基因集合之间的调控网络并鉴定关键调控基因的方法15。该方法多被用于研究共表达网络与植物性
14、状之间的生物学关系,能够辅助挖掘与目标性状高度关联的核心基因。本研究利用谷子的根、叶、穗、茎等不同组织、不同冷处理条件下的 33 份转录组数据,利用WGCNA方法构建谷子共表达网络模块,并进行差异表达分析,将冷胁迫处理组与对照组进行比较,设置错误发现率(false discovery rate,FDR)阀值为0.01筛选差异,与WGCNA模块相结合,在模块中找出谷子抗冷基因,预测与谷子耐冷相关的候选基因,为进一步研究谷子的抗逆机理奠定基础。1材料与方法1.1谷子RNA-Seq数据的获取与分析谷子品种 豫谷1号(Yugu 1)冷胁迫处理的部分转录组数据中来源于 NCBI(national cen
15、ter for biotechnology information)的 SRA(sequence read archive)数据库(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/),从 豫谷 1 号 12 d 的幼苗期开始,分别在6 冷胁迫处理0.0、0.5、1.0、3.0、6.0、16.0、24.0 h,在每个时间点分别从对照组和冷胁迫处理组同时取样,进行RNA测序16。xiaomi突变体的11个不同组织、时期的转录组数据来自于本实验室4,数据已上传 NGDC(national genomics data center)的GSA(genome sequence archiv
16、e)数 据 库(https:/ 晋谷 21(JG21)、牛毛白(NMB)和 平定 大 谷 (PD)种 子 播 种 于 山 西 省 太 谷 县(3725 13 N,11235 26 E)大田。取 晋谷21出苗2周整株幼苗的混合叶、种植30 d的倒2叶及灌浆期S2、S4时期未成熟的种子;对于 牛毛白及 平定大谷 均只取灌浆期S2、S4时期未成熟的种子。将所有样品取样后立即置于液氮中,随后23中 国 农 业 科 技 导 报25 卷采用RNAprep纯植物试剂盒(天根生化科技有限公司)分离总RNA,并送样测序,每个样本3个生物学重复。对于NCBI下载的数据首先将SRA格式文件利用SRAtoolkit软
17、件的fast-dump命令转换为fastq序列文件17。所有的测序原始数据利用 FastQC对其进行质控18,然后利用Trimmomatic软件(软件中参数 threads 设为 10,phred 设为 33)去除接头,过滤掉低质量的 reads,得到 clean data19。利用Hisat2(参数phred设为12)将clean data比对到本团队构建的谷子超早熟突变体xiaomi高质量基因组20。利用featurecounts21对数据的reads计数,之后根据基因表达的TPM(transcripts per million)值,编写计算TPM值的R语言代码,构建基因表达矩阵22。TP
18、Mi=XiLi 1jXjLj 106(1)式中,xi和xj分别表示比对到基因i上的reads数和比对到任一基因j上的reads数;Li表示基因i的外显子长度的总和;Lj表示任一基因j的外显子长度总和。1.2共表达网络构建基因的表达量矩阵来自于谷子不同组织不同处理下的基因表达量。参照Langfelder23的方法,使用 R 软件(R version 3.4.4)中的 WGCNA 包(R version 1.6.6)构建加权基因共表达网络。利用WGCNA 包中的 pickSoftThreshold 函数计算权重值,根据谷子转录组数据不同软阈值下的网络拓扑结构分析结果,选择软阈值 power=12,
19、使用默认参数利用函数 blockwiseModules 构建无尺度网络。1.3谷子耐冷基因检索及差异表达基因分析通过国家水稻数据中心(http:/ 0.01 且|log2FC|2 进行差异表达基因分析,用在线软件(http:/jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html)制作韦恩图25,并统计差异表达基因在上述3个模块中的分布数目。1.4模块的GO富集分析提取出含冷胁迫基因最多的3个模块,利用TBtools软件对3个模块中的所有基因进行GO富集分析26;之后选出模块内与冷GO注释相关的基因,利用Cytoscape(version 3.6)对模块中的这些基因进行
20、可视化27。1.5冷胁迫候选基因功能注释将核心基因在水稻(https:/rapdb.dna.affrc.go.jp)及玉米数据库(https:/www.maizegdb.org)中进行同源比对,设置阈值E-value85%进行筛选,参照水稻和玉米中的同源基因功能进行注释。1.6冷胁迫应答候选基因的实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析为了验证冷胁迫应答候选基因的表达模式,对其中6个候选基因进行了RT-qPCR分析。将 预谷1号 播种12 d后对其进行6 冷胁迫处理,分别在处理0、3、6、24 h时,从对照组和冷胁迫处理组取样(地上部),每组样本取3个生物学重复,使用博迈德Green qPCR
21、 Master Mix荧光定量试剂盒进行RT-qPCR验证,检测候选基因对冷胁迫的响应情况。用NCBI的Primer-BLAST(https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome)进行引物设计,如表1所示。内参基因为谷子Actin基因,并采用2-Ct方法28计算基因的相对表达量。2结果与分析2.1谷子加权基因共表达网络构建利用 WGCNA 包中的 goodSamplesGenes 函数检测并过滤掉表达量偏低的基因,最终获得32 017 个高表达基因。利用 WGCNA 包内的pickSoftTh
22、reshold 函数计算并选择权重值=12(R2=0.8),以实现所有基因构成的关系网络符合无尺度网络分布。按权重值=12,计算并获得每2 个基因间的拓扑重叠矩阵(topological overlap matrix,TOM);之后采用动态剪切算法进行共表达网络模块划分,最终得到44个共表达模块,如图1所示,图中每种颜色代表聚成一簇的基因所形成2410 期张会等:基于WGCNA的谷子苗期冷胁迫应答基因网络构建与核心因子发掘的模块。其中 darkturquoise 模块包含的基因最多,有7 415个;navajowhite模块包含的基因最少,仅37个。2.2冷胁迫相关模块提取利用水稻已报道的与冷
23、胁迫直接相关的基因在谷子数据库中进行检索比对,共鉴定到68个冷胁迫候选基因。通过映射查找,这些基因分布于18 个 共 表 达 网 络 模 块,其 中,darkturquoise、turquoise、blue模块中所含的耐冷基因数量较多,分别为13、10、8个。为了评估冷胁迫相关基因映射选取模块的准确性,对谷子冷胁迫处理 0.5、1.0、3.0、6.0、16.0和24.0 h的转录组数据进行差异表达基因分析。结果显示,turquoise模块中不同处理下的差异基因 数 量 最 多,占 所 有 差 异 基 因 数 的 12.69%;darkturquoise 模 块 中 的 差 异 基 因 数 次
24、之,占12.06%;blue模块中差异基因数占7.68%。对6种冷胁迫处理的差异表达基因进行分析(图2),发现有9个基因在6种冷胁迫时间下均差异表达。通过同源比对,这9个基因在水稻和拟南芥(Arabidopsis thaliana)中的同源基因主要涉及 TPR、AP2、WRKY、bHLH、TIFY、PAO2 和 MYB家族以及赤霉素、冷调控等相关功能(表2),这些家族均与植物非生物胁迫应答相关29-31。表1RT-qPCR引物序列Table 1RT-qPCR primer sequence基因GeneActinSi2g38970Si3g02940Si3g08050Si5g36480Si6g03
25、220Si9g50340上游引物Forward primer(5-3)TGCTCAGTGGAGGCTCAACAGCCGGATGTTCTGGTGGTATTATACCGCACCAGCGATGACCTCCGACACCGACTCATTCTCAGCATCCCCAGAGAGCAAAGAGCATCGTGCTGTCAGAGGCCTCACAGACATGCCCATCG下游引物Reverse primer(5-3)CCAGACACTGTACTTGCGCTCCCTTGAAACTGCGTTCACCGTCCTTTGGGACCTGATTGCCAAGAAGATGACCGACACCCGGCACCTTGGGAACTGTGTCTC
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