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DMB衍生-高效液相色谱法测定重组人促卵泡激素中的唾液酸含量.pdf
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1、中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.189DOI:10.19803/j.1672-8629.20230498 中图分类号:R917文献标志码:A 文章编号:1672-8629(2024)01-0089-05基金项目:国家重点研发计划(2021YFF0600804)。作者简介:王绿音,女,硕士,助理研究员,激素类药物质量控制研究。*通信作者:梁成罡,男,研究员,激素类药物质量控制研究。E-mail:#为共同通信作者。随着女性生育年龄的推迟和不孕不育率的逐年增加,辅助生殖药物市场规模持续增长1。促卵泡激素是辅助生殖技术临床应用最
2、为广泛的药物,其中重组人促卵泡激素(recombinant human follicle stimulating DMB 衍生-高效液相色谱法测定重组人促卵泡激素中的唾液酸含量 王绿音,李懿,孙悦,胡馨月,张慧,李晶#,梁成罡*(中国食品药品检定研究院化学药品检定所,国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室,国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室,北京 102629)摘要:目的建立采用 4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐(DMB)衍生-高效液相色谱-荧光检测器(HPLC-FLD)法(DMB 衍生法)同时测定重组人促卵泡激素(rhFSH)中 2 种唾液酸组分 N-羟
3、乙酰神经氨酸(Neu5Gc)和N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)含量的方法。方法将DMB 衍生法与邻苯二胺衍生-高效液相色谱法(邻苯二胺衍生法)进行对比研究,对 DMB 衍生法中的水解条件进行优化并确定最终方法为 rhFSH 原液经酸水解后,采用 DMB 进行衍生,经 Agilent ZORBAX 300SB-C18色谱柱(250 mm4.6 mm,5 m)分离,采用荧光检测器检测。结果与邻苯二胺衍生法相比,DMB 衍生法能够实现 Neu5Gc 与Neu5Ac 相关杂质的有效分离。该方法 Neu5Gc 和 Neu5Ac 分别在 0.5 5.0 g mL-1(r=0.999 9)和 25 250
4、gmL-1(r=0.999 8)浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系;Neu5Gc和 Neu5Ac 的检测限分别为11.07、10.30 ngmL-1,定量限分别为 33.21、20.60 ngmL-1,两者回收率分别为(99.631.33)%(n=9)和(100.621.58)%(n=9),RSD 分别为1.3%(n=9)和1.5%(n=9)。结论该方法专属性强、灵敏度高、精密度和准确度良好,可用于准确测定 rhFSH中唾液酸 Neu5Gc 和 Neu5Ac 的含量。关键词:重组人促卵泡激素;高效液相色谱法;DMB 衍生;荧光检测器;N-羟乙酰神经氨酸;N-乙酰神经氨酸;含量;唾液酸 Dete
5、rmination of sialic acid in recombinant human follicle stimulating hormone by high performance liquid chromatography with DMB derivatizationWANG Lyuyin,LI Yi,SUN Yue,HU Xinyue,ZHANG Hui,LI Jing#,LIANG Chenggang*(Institute for Chemical Drug Control,National Institutes for Food and Drug Control,Key La
6、boratory of the Ministry of Health for Research on Quality Study and Evaluation of Biotech Products,Key Laboratory of the Ministry of Health for Research on Quality Study and Evaluation of Chemical Drugs,Beijing 102629,China)Abstract:Objective To develop a 4,5-methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dih
7、ydrochloride(DMB)derivatization method based on high-performance liquid chromatography-fluorescence detector(HPLC-FLD)(DMB derivatization method)that can concurrently quantify both N-glycolylneuraminic acid(Neu5Gc)and N-acetylneuraminic acid(Neu5Ac)in rhFSH.Methods A comparative study was undertaken
8、 between the o-phenylenediamine derivatization method based on high-performance liquid chromatography(o-phenylenediamine derivatization method)and DMB derivatization method.The optimized DMB derivatization method with refined hydrolysis conditions was established and demonstrated as follows:The rhFS
9、H solution was first subjected to acid hydrolysis,followed by derivatization with DMB.The resulting solution was then separated using an Agilent ZORBAX 300SB-C18 chromatographic column(250 mm4.6 mm,5 m)and analyzed by a fluorescence detector.Results When compared to the o-phenylenediamine derivatiza
10、tion,the optimized DMB derivatization method proves to be more effective in separating Neu5Gc and Neu5Ac related impurities.The optimized DMB derivatization method showcases superior specificity,with both Neu5Gc and Neu5Ac demonstrating a strong linear relationship with peak area within the concentr
11、ation ranges of 0.55.0 g mL-1(r=0.999 9)and 25250 g mL-1(r=0.999 8).The limit of detection and quantification(LOD and LOQ)for Neu5Gc are impressively low as 11.07 ngmL-1 and 33.21 ngmL-1 respectively,comparable to the levels of Neu5Ac(LOD:10.30 ngmL-1,LOQ:20.60 ngmL-1).Besides,the recovery rates for
12、 Neu5Gc and Neu5Ac are(99.631.33)%(n=9)and(100.621.58)%(n=9),with low RSDs of 1.3%(n=9)and 1.5%(n=9),respectively.Conclusion The method demonstrates commendable specificity,exceptional sensitivity,and noteworthy precision and accuracy,which would be ideally suited for the precise quantification of N
13、eu5Gc and Neu5Ac content in rhFSH.Keywords:recombinant human follicle stimulating hormone(rhFSH);high-performance liquid chromatography;DMB derivatization;fluorescence detector;N-glycolylneuraminic acid;N-acetylneuraminic acid;content;sialic acid基础与临床研究中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.
14、21,No.190光检测器(美国 Waters 公司,型号:Alliance e2695-2475);电子天平(METTLER TOLEDO 公司,型号:AG245);超纯水机(美国Millipore 公司,型号:Milli-Q IQ7000)。1.2 试药rhFSH 原液样品(编号13来自企业 A,编号46来自企业B,编号7来自企业C,均由本实验室保存);Neu5Ac对照品(USP reference standard,批号:FOH186,每1 mg 中含 0.894 mg Neu5Ac),Neu5Gc 对照品(USP reference standard,批号:R134L0,每1 mg中含
15、 0.975 mg Neu5Gc);DMB(日本 TaKaRa 公司,批号:AM72030A,内含 DMB Solution 和 Coupling Solution);邻苯二胺、硫酸氢钠、盐酸、乙酸均为分析纯,购自国药化学试剂有限公司;乙腈、甲醇为色谱纯,购自Fisher 公司;实验用水为纯化水。2 实验方法2.1 DMB 衍生法2.1.1 溶液制备 对照品储备液制备:精密称取 Neu5Ac对照品 25 mg,置 25 mL 量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,作为 Neu5Ac 对照品储备液;精密称取 Neu5Gc 对照品 25 mg,置 25 mL 量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,作为
16、Neu5Gc对照品储备液;精密量取上述 Neu5Gc对照品储备液 1 mL,置100 mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,作为 Neu5Gc 对照品储备液 II。混合对照品溶液:精密量取 Neu5Ac 对照品储备液 2.5 mL,Neu5Gc 对照品储备液 II 5.0 mL于10 mL量瓶中,加水稀释至刻度,摇匀,即为每1 mL含Neu5Ac 250g 和 Neu5Gc 5g 的混合对照品溶液(标准曲线溶液 1)。标准曲线溶液:取混合对照品溶液 1 000、600、400、200、100L,分别加水 0、400、600、800、900L,混匀,配置成 Neu5Ac 理论浓 度 为 250、15
17、0、100、50、25gmL-1,Neu5Gc 理论浓度为 5.0、3.0、2.0、1.0、0.5gmL-1的系列标准曲线溶液,标记为标准曲线溶液1、2、3、4、5。精密吸取上述系列标准曲线溶液 25L,加入 0.5 mol L-1硫酸氢钠溶液 25L,涡旋混匀,离心,80保温1 h,冷至室温。精密吸取 10L,加入 DMB 标记溶液(DMB SolutionCoupling Solution水=154)100 L,涡旋混匀,离心,50 保温 2.5 h,冷至室温。供试品溶液:取rhFSH 原液,用原液缓冲液将其稀释至每1 mL约含1 mg 的溶液,按“标准曲线溶液”项下方法操作,即得。空白对
18、照溶液:制备不含rhFSH 的原液缓冲液,按“标准曲线溶液”项下方法操作,即得。hormone,rhFSH)因生物活性、纯度和安全性上均优于尿提取人卵泡刺激素,市场份额已达 70%以上2-3。因此,提高和完善 rhFSH 药物的质量控制方法,对该类药物的监管具有重要意义。唾液酸化程度是治疗性重组糖蛋白生物制品的关键质量属性,因其会对药物的疗效、半衰期、稳定性和安全性等产生影响,在生产、储存和可比性研究中需要对其进行密切监测和控制4。用于生产治疗性糖蛋白的细胞主要是哺乳动物细胞系5,其表达产生的糖蛋白含有 N-乙酰神经氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)和N-羟乙
19、酰神经氨酸(N-glycolylneuraminic acid,Neu5Gc)2 种唾液酸,而在人体中,由于单磷酸胞苷-N-乙酰神经氨酸羟化酶(cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase,CMAH)基因中一个关键外显子的缺失,只能生成 Neu5Ac6。药物中外源性唾液酸 Neu5Gc 存在潜在的免疫原性风险,可诱发与慢性炎症相关的疾病(如癌症、心血管和自身免疫疾病);该复合物还可能诱导补体激活效应,导致药物的清除从而影响疗效7。已上市的 rhFSH 药物,均系非人哺乳动物细胞表达,含有上述 2 种唾液酸。然而,现行质量标
20、准采用邻苯二胺衍生-高效液相色谱法(邻苯二胺衍生法),仅测定 rhFSH 原液中 Neu5Ac 的含量,缺少对Neu5Gc 的控制。为了确保患者的用药安全,研究建立可同时测定 rhFSH 原液中Neu5AC 和 Neu5Gc 含量的方法十分必要。中华人民共和国药典(2020 年版)测定唾液酸含量采用的是比色法,该法测定的是总唾液酸,无法区分 Neu5Ac 和 Neu5Gc8。已上市产品均采用邻苯二胺衍生法仅对 Neu5Ac 进行测定,研究尝试在原方法基础上进行优化使其可以同时定量Neu5Ac与Neu5Gc,发现无法实现 Neu5Gc与Neu5Ac 相关杂质的有效分离,且灵敏度较低,难以对产品中
21、微量的 Neu5Gc 进行准确定量。4,5-亚甲二氧基-1,2-苯二胺二盐酸盐(DMB)衍生-高效液相色谱法(DMB 衍生法)具有特异性强、灵敏度高等特点9,近年来被大量用于生物技术药物的唾液酸含量检测。本研究采用 DMB 衍生法研究建立了rhFSH原液中 Neu5Ac 和 Neu5Gc 的含量测定方法,可用于rhFSH 原液的常规放行检验。1 仪器与试药1.1 仪器高效液相色谱仪-荧光检测器(美国安捷伦公司,型号:1260 Infinity II);高效液相色谱仪-荧中国药物警戒 第 21 卷第 1 期 2024 年 1 月 January,2024,Vol.21,No.1912.1.2 色
22、谱条件 色谱柱为 Agilent ZORBAX 300SB-C18柱(250 mm4.6 mm,5 m),流动相 A为乙腈,流动相 B为含 0.77%甲醇的水溶液;流速0.5 mL min-1;洗脱梯度:91%流动相 B 保持 20 min,1 min 内流动相 B 降至0%,保持 9 min;进样器温度:6;进样量:5L;柱温:55;荧光检测器:激发波长为 373 nm,发射波长为 448 nm。2.1.3 测定法 精密量取标准曲线溶液、供试品溶液和空白对照溶液注入液相色谱仪,分别记录色谱图,采用标准曲线法以峰面积计算。2.2 邻苯二胺衍生法由于已上市产品采用的邻苯二胺法仅对产品中的 Neu
23、5Ac 进行定量,故首先尝试在原方法基础上增加 Neu5Gc 标准品,探索其同时定量 Neu5Ac 与Neu5Gc 的可行性。2.2.1 溶液制备 供试品溶液:精密吸取样品 50L,加入 0.5 molL-1硫酸氢钠溶液 50L,涡旋混匀,离心,80保温 20 min,冷至室温。精密加入邻苯二胺溶液(20 mgmL-1的 1 molL-1盐酸溶液)100L,涡旋混匀,离心,80保温 40 min,冷至室温。对照品溶液:精密称取 Neu5Ac 对照品适量,用水稀释制成每1 mL 中约含 Neu5Ac 100g 的溶液,精密吸取50L,按“2.1.1 溶液制备-供试品溶液”项下方法衍生化,即为 N
24、eu5Ac 对照品溶液。同法制备 Neu5Gc对照品溶液。空白溶液:制备不含 rhFSH 的原液缓冲液,按“2.1.1 溶液制备-供试品溶液”项下方法衍生化,即得。2.2.2 色谱条件 色谱柱Waters Symmetry C18柱(150 mm 4.6 mm,5 m),流动相 A 为含 0.15%1-氨基丁烷、0.5%磷酸、1%四氢呋喃的水溶液,流动相 B 为含 50%乙腈的水溶液;流速 1.0 mL min-1;洗脱梯度:13%流动相 B 保持 20 min,1 min 内流动相 B升至 100%,维持 8 min;进样器温度:6;进样量:20L;柱温:25;检测波长:214 nm。2.3
25、 方法学验证2.3.1 专属性 按“2.1.1”项下配制标准曲线溶液 3、供试品溶液和不含 rhFSH 的原液缓冲液,分别精密量取 5L 注入液相色谱仪。2.3.2 线性 按“2.1.1”项下方法配制系列标准曲线溶液,平行制备 3 份,分别以 Neu5Ac 和 Neu5Gc 浓度为横坐标,以峰面积的平均值为纵坐标进行线性回归。2.3.3 准确度 取“2.1.1”项下的混合对照品溶液700 L,加水 300 L,混匀,配置成 Neu5Ac 理论浓度为 75g mL-1,Neu5Gc理论浓度为1.5g mL-1的溶液,标记为标准曲线溶液 6。取 rhFSH 原液适量,等体积加入标准曲线溶液 2、3
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