红苞凤梨AbF3′5′H基因上游调控因子筛选_林东璞.pdf

浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis，2023，35(1):79 89http:/www zjnyxb cn林东璞，臧要强，张霄鹏，等 红苞凤梨 AbF35H 基因上游调控因子筛选 J 浙江农业学报，2023，35(1):79 89DOI:10.3969/j issn 1004-1524.2023.01.09收稿日期:2022-03-28基金项目:国家自然科学基金(31971704，31770743)作者简介:林东璞(1998)，男，山东聊城人，硕士研究生，研究方向为观赏植物分子生物学。E-mail:373057871 qq com*通信作者，马均，E-mail:422572009 qq com红苞凤梨 AbF35H 基因上游调控因子筛选林东璞，臧要强，张霄鹏，周徐子鑫，马均*(四川农业大学 风景园林学院，四川 成都 611100)摘要:颜色是观赏植物最重要的性状之一，也是当前观赏园艺育种的一个重要方向。为研究红苞凤梨红蓝色彩的呈现机制，初步分析金边红苞凤梨(Ananas comosus var bracteatus)不同组织中花青素种类与含量，用AbF35H 基因启动子构建诱饵载体，利用酵母单杂交(Y1H)文库筛选其上游调控转录因子;并采用酵母单杂交验证技术，验证筛选出的转录因子与 AbF35H 启动子的互作关系。结果表明:花青素的种类组成和相对比例决定了组织的颜色性状，AbF35H 是花青素合成途径种类分支的关键基因，在花青素种类组成与相对比例调控中具有重要作用;AbBTB/POZ、AbHSP81-1 和 AbGLOX 能够与 AbF35H 的启动子结合而调控其转录，可能在红苞凤梨花青素合成代谢调控中发挥重要作用。研究结果对于进一步揭示红苞凤梨花青素合成代谢调控机理，研究红苞凤梨呈色机理，培育叶色新品种有着重要的理论和实践意义。关键词:红苞凤梨;F35H 基因;花青素;酵母单杂交;调控因子中图分类号:S682.36文献标志码:A文章编号:1004-1524(2023)01-0079-11Screening of upstream regulators of AbF35H gene in Ananas comosus var bracteatusLIN Dongpu，ZANG Yaoqiang，ZHANG Xiaopeng，ZHOU Xuzixin，MA Jun*(College of Landscape Architecture，Sichuan Agriculture University，Chengdu 611100，China)Abstract:Color is one of the most important traits of ornamental plants and also an important direction of ornamentalhorticulture breeding To investigate the presentation mechanism of red-blue color of Ananas comosus var bracteatus，the primary analysis of the kinds and concentration of anthocyanins in different tissues had been made，the promoterof AbF35H was used to build the bait vector，and the yeast one-hybrid(Y1H)library was used to select the tran-scription factors that control the genes upstream activity;The yeast one-hybrid technique was used to verify the inter-action between the selected transcription factors and the AbF35H promoter The results showed that the phenotypiccolor of the tissues were determined by the kinds and relative proportion of anthocyanins AbF35H was a key genefunctioned in the species branch determination of the anthocyanin synthesis pathway，and was crucial for regulatingthe kinds and relative proportion of anthocyanins;AbBTB/POZ，AbHSP81-1 and AbGLOX-like could bind to thepromoter of AbF35H to regulate its transcription，suggesting that they might play important role in the regulation ofanthocyanin anabolism in A comosus var bracteatus These results had important theoretical and practical signifi-cance in understanding the regulation mechanism of anthocyanin biosynthesis，investigating the color formation mech-anism and cultivating new leaf color variants of A comosus var bracteatusKey words:Ananas comosus var bracteatus;F35H;yeast one-hybrid;regulatory factor红苞凤梨(Ananas comosus var bracteatus)是一种来源于热带的凤梨属多年生常绿草本观赏植物，因其果型独特、色彩艳丽、株型优美而成为重要的新型观赏植物，果枝作鲜切花保鲜可达 1个月以上，也是新型的切花植物1。金边红苞凤梨具有绿白镶嵌的金边嵌合叶片，叶果兼赏2，叶片在春秋季和花期会因花青素的积累而呈现出红色，叶片色彩显著，观赏期长，极大地提高了红苞凤梨的观赏价值3 4。植物的颜色由组织细胞中不同种类的色素以一定的比例组合形成，而在以红-紫-蓝色系为主的观赏植物中，花青素的种类和含量起主导作用5。近年来，植物颜色的研究主要集中在花青素的生物合成代谢途径上，通过分子手段对观赏植物的颜色性状进行改良。在具体应用方面，蓝色观赏植物的培育仍然是业内的一大热点，前人研究认为植物产生蓝色性状需要 3 个条件:呈色物质飞燕草素的积累、黄酮醇或者黄酮糖苷等物质的积累和较高的 pH 值6 7。类黄酮 3 5-羟化酶(flavonoid 3 5-hydroxylase，F35H)是花青素生物合成途径中的关键酶，可通过与二氢山奈酚反应生成二氢杨梅素，后续生成蓝色飞燕草色素，对植物蓝色表型的形成起到举足轻重的作用，因此 F35H 基因又被称为蓝色基因8。Hol-ton 等9 于 1993 年将矮牵牛 F35H 基因导入缺少该基因的粉色系矮牵牛中，使得飞燕草色素大量积累，花色最终呈现蓝紫色。Okinaka 等10 将风铃草、矮牵牛和洋桔梗的 F35H 基因导入本氏烟草后发现，风铃草的 F35H 基因可以在烟草中高效表达，从而使烟草花瓣中飞燕草色素大量积累，经测量飞燕草素含量约为转基因前的 2倍。F35H 基因的表达水平很大程度上决定了花青素的种类组成和飞燕草素的相对含量，而在高等植物中，基因的表达水平受到多种因素的影响，其中转录水平调控基因表达的研究较为深入，在目前对 F35H 基因的表达调控研究中已发现 MYB、bHLH、WD40 家族转录因子对 F35H的表达起到重要的调控作用11 13。酵母单杂交技术起源于酵母双杂交技术，主要应用于研究调控基因的上游转录因子，该技术依据酵母 GAL4 转录因子的结构域特性，通过将诱饵载体和 cDNA 文库连接后观察报告基因的表达情况来判断文库内是否存在调控该基因的上游转录因子14。目前酵母单杂交技术已广泛应用于研究植物代谢途径和调控机理方面，郭育强等15 通过构建木薯酵母单杂交文库并用 MeC-WINV6 启动子片段进行筛库工作，筛选出 3 个转录因子和 1 个线粒体受体，为进一步研究提供了候选转录因子;郭荣荣等16 为研究葡萄成花调控机理，对夏黑葡萄 VlTFLlA 基因启动子进行了筛库工作，最终选出 9 个调控因子;李晓雪17 通过酵母单杂试验筛选出 DkMYB9 转录因子，后续通过双荧光素酶试验，证明了 DkMYB9 与目的基因存在相互作用。红苞凤梨的花瓣为蓝色，叶片和苞片为红色，呈现出不同的花青素积累特性。本研究对红苞凤梨不同颜色的组织进行花青素种类与含量的测定，厘清花青素的种类组成和相对含量对组织颜色的决定作用;并对红苞凤梨 AbF35H 基因及其启动子序列进行克隆，将序列结果进行生物信息学分析;根据分析结果构建诱饵载体后进行酵母单杂交筛选，筛选调控 AbF35H 基因的上游转录因子;对筛选出的上游转录因子采用酵母单杂交验证互作关系，以期为 AbF35H 基因表达调控机制的研究提供候选转录因子。1材料与方法1.1材料金边红苞凤梨种植于四川农业大学试验苗圃。DH5 感受态细胞、Y1H 酵母感受态细胞、pAbAi 质粒均购买于 Solarbio 公司，DL marker2000、DL marker 5000 与核酸染料采购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司，金担子素 AbA、In-sert Check Mix 1 酶采购于索莱宝生物工程(大连)有限公司。1.2花青素种类与含量测定于2021 年10 月红苞凤梨颜色最鲜艳时分别选择红苞凤梨红色叶片、红色苞片和紫色花瓣组织进行取样，材料分别取自 3 棵不同植株作为重复。对植物材料进行真空冷冻干燥处理，处理后研磨成粉末状，将粉末溶于提取液(80%甲醇水溶液，含 0.1%盐酸)后涡旋振荡 10 min，超声处08浙江农业学报第 35 卷第 1 期理 10 min 后离心取上清液，过滤后使用 LC-ESI-MS/MS 分析。色谱条件:色谱柱 ACQUITY BEHC18 1.7 m，2.1 mm 100 mm;流动相 A 相为超纯水(加入 0.1%甲酸)，B 相为甲醇(加入 0.1%甲酸);洗脱梯度:0 min B 相比例为5%，6 min 时增至 50%，12 min 时增至 95%，保持 2 min，14min 时降至 5%，并平衡 2 min;流速控制在 0.35mL min1;柱温 40;进样量 2 L。该方法能够检测到极性高、热稳定性差的化合物，并能够对物质进行精确定量。花青素在植物体属于次级代谢物，液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)能够满足花青素准确定性和定量的要求18。1.3红苞凤梨 AbF35H 基因克隆与分析以红苞凤梨植株的花瓣作为克隆材料，提取RNA 后使用试剂盒反转录为 cDNA 作为基因克隆模板，设置 3 个生物学重复。课题组前期已经完成红苞凤梨基因组测序、组装的相关工作19，通过本地化 Blast 比对在数据库中对符合 F35H基因特点的序列进行初步筛选，最终筛选出序号为 Aco_HBLgroup1g004620 的基因，经 CD-Search工具分析保守结构域初步判定该基因为 AbF35H。利用 Primer Premier 6.0 设计引物(AbF35H-F、AbF35H-R)进行序列扩增(引物见表 1)，将正确条带纯化回收后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，对正确测序结果进行 Blast 对比，同时分析其开放阅读框(open reading frame，ORF)与蛋白质理化性质，预测其蛋白质结构。1.4AbF35H 基因启动子克隆与分析使用 CTAB 法提取红苞凤梨花瓣的 DNA 作为启动子克隆的模板，从基因组数据库中筛选出AbF35H 基因上游 2 000 bp 作为启动子序列，将表 1引物序列Table 1The sequences of primers引物名称Primer name引物序列Primer sequence(53)AbF35H-FGGACGTTATCGTCCTCCTACGAbF35H-RCGGCACAGTCTTTTGTAGCGPr F35H-A-FTAAGTCCATTTGAAACAGAAPr F35H-A-RTTTGTGAAGATTAAGAAGGCPr F35H-B-FTTAAAATTCAAATGACTGTCCAAAAPr F35H-B-RTTTTGGACAGTCATTTGAATTTTAAF35H-FCCCGCATCATCATAACCAGCF35H-RGCTTCAGGGAATCAGGGTGG启动子分为两段 1 500 bp 的序列，分别设计引物Pr F35H-A-F、Pr F35H-A-R 与 Pr F35H-B-F、Pr F35H-B-R 进行克隆。对长度正确的条带进行回收并连接 Blunt simple 007 载体，转入 DH5大肠埃希菌后将阳性菌提质粒测序。在完成启动子序列克隆后，使用启动子顺式作用元件预测工 具PlantCARE(http:/bioinformaticspsbugent be/webtools/plantcare/html/)对序列进行分析20。1.5诱饵载体 pBait-AbF35H 构建根据启动子分析结果选择目标顺式作用元件密集区设计引物 F35H-F、F35H-R，该区域位于 AbF35H 基因 ATG 上游 100 350 bp。跑出目标序列条带并纯化回收后转入 DH5 大肠埃希菌，提质粒确定测序结果，用 Kpn和 Sal分别将测序正确的质粒与 pAbAi 载体进行双酶切，酶切产物分别纯化回收后用 T4 连接酶连接，连接后转 DH5 扩繁，选取单菌落提质粒进行酶切检测，对长度合适的进行测序验证。1.6诱饵载体和阴性对照转化酵母菌株使用 Bstb酶对已构建好的诱饵载体 pBait-AbF35H 和阴性对照 pBait-AbAi 分别进行线性化处理，并转入 Y1H Gold 酵母菌株中，使用一缺培养基 SD-Ura 进行培养筛选，置于 30 培养箱中培养 3 4 d 后，挑取单菌落，使用 MatchmakerInsert Check PCR Mix 1 试剂进行菌液 PCR 检测，检测 阳 性 对 照 与 诱 饵 载 体 是 否 转 入 Y1HGold 中。1.7诱饵载体最低 AbA 抑制浓度的筛选配制含 100、150、200、250 ng mL1金担子素A(AbA)的 SD-Ura 培养基，使用牙签分别挑取少量诱饵载体与阳性对照菌体混匀在 100 L 无菌水中，分别稀释 10、100、1 000 倍后吸取 2 L 点在 SD-Ura/AbA 培养基上，30 培养3 4 d 后观察酵母菌落生长情况。最低 AbA 抑制浓度即为酵母完全无法生长的培养基上的 AbA 浓度。1.8酵母单杂筛库将含诱饵载体酵母菌于 100 mL YPDA 培养液中培养至 D600为 0.4 0.5，收集菌体后使用TE/LiAC 与 PEG/LiAc 将其制备为感受态，后加入酵母文库质粒培养 90 min，取 200 L 涂布于SD-Leu/AbA 培养基上，30 培养5 7 d，进行初18林东璞，等 红苞凤梨 AbF35H 基因上游调控因子筛选步筛选。初筛过后挑取单克隆反复转板进行假阳性排除，排除过程中可以适当提高 AbA 浓度，将转板过后依旧生长的酵母菌抽提质粒，将质粒转入 DH5 大肠埃希菌中扩繁后再次抽提质粒，最后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果在 NCBI 上进行比对，初步分析筛出的基因序列。1.9酵母单杂交互作验证将筛出的阳性克隆质粒转入含诱饵载体的Y1H Gold 感受态中，振荡培养 60 min 后取 100L 分别稀释 10、100 倍后涂布于 SD-Leu/AbA(260 ng mL1)培养基上，以此来回转验证单杂筛库结果。若该转录因子确实与 AbF35H 存在互作，则酵母可以正常生长，验证过程使 用pGADT7 空载体作为对照。2结果与分析2.1红苞凤梨不同组织花青素种类和含量经 LC-ESI-MS/MS 检测显示，金边红苞凤梨的叶片、苞片和花瓣中都含有飞燕草素、天竺葵素、矢车菊素、锦葵色素、矮牵牛花色素和芍药花色素 6 大类花青素，是少有的可以同时合成积累6 大类花青素的植物。3 种不同组织材料的花青素种类和含量如图 1 所示。红色叶片边缘组织中矢车菊素苷占总花青素含量的 97.42%，而蓝色飞燕草素苷仅占 1.91%，因此叶片呈现艳丽的红色;红色苞片中矢车菊素苷占总花青素含量的55.07%，芍药花色素占 39.45%，这 2 种色素在植物细胞内都呈现红色，同时飞燕草素占比仅达0.9%，因此苞片呈现红色;花瓣中蓝色飞燕草素在总 花 青 素 含 量 中 的 占 比 显 著 升 高，达 到32.74%，而矢车菊素苷只占总花青素含量的47.30%，花瓣呈现出蓝紫色。说明红色花青素和蓝色花青素的相对含量决定了红苞凤梨组织红、蓝颜色的呈现，通过调控叶片中飞燕草素苷的相对比例，可以培育新的叶色种质材料。2.2AbF35H 基因的生物信息学分析以 cDNA 为模板进行扩增，得到长度为1 530bp 的基因片段(图 2-A)。经 Blast 比对发现，该序列与菠萝(XM_020246386.1)的核苷酸序列相似性最高，达 94.78%，与野蕉(THU68827.1)、小图 1红苞凤梨不同组织花青素种类与含量Fig 1Species and contents of anthocyanin in differenttissues of Ananas comosus var bracteatus果野蕉(XP_009411862.1)等物种序列相似性70%以上。经 ORF Finder 分析发现，AbF35H 序列包含一个长度为 1 530 bp 的开放阅读框，编码509 个氨基酸。蛋白质分子式为 C2541H4071N723O691S29，分子量(Mw)与 等 电 点(pI)分 别 为56 735.45和 9.18，含带负电荷残基(Asp+Glu)53 个，带正电荷残基(Arg+Lys)62 个，蛋白稳定指数为 38.90，因此其结构功能都较为稳定。使用 SWISS-MODEL 对其蛋白质三维结构进行预测，发现其 GMEQ 值为 0.69，QMEAN 值为 0.71，M，DL2000 marker。1 4 为 PCR 扩增产物。M，DL2000 marker1 4 were products amplified by PCR图 2AbF35H 基因全长序列琼脂凝胶电泳图(A)与蛋白质三维结构(B)Fig 2Gel electrophoresis of full length sequence cloningof AbF35H gene(A)and three dimensional structure ofAbF35H protein(B)28浙江农业学报第 35 卷第 1 期表明该蛋白质为高质量蛋白质，与模板匹配度较高，结构如图 2-B。经 NCBI 的 CD-Search 分析发现，AbF35H基因编码的氨基酸与 PLN00110 和 Cyp 基因家族有关，其中有 5 条保守结构与都与 Cyp 有关，说明 AbF35H 属于 p450 蛋白家族。2.3AbF35H 基因启动子的顺式作用元件克隆得到长度为 2 020 bp 的启动子序列，使用 Plant CARE 对启动子序列进行顺式元件在线预测，并通过 TBtools 对预测结果进行可视化处理。结果(表 2)表明，AbF35H 基因启动子中含有大量的光响应元件，如 ATCT-motif、Box 4、G-Box、MRE，除此之外还含有一些激素和逆境响应元件，如脱落酸响应元件(ABRE)、低温响应元件(LTR)、创伤反应元件(WUN-motif)等，以及在花青素合成途径中非常关键的 MYB 响应元件。这表明 AbF35H 基因可能受到光、逆境、激素，以及花青素相关转录因子的诱导和调控。2.4诱饵载体与诱饵菌株鉴定根据启动子分析结果，选择顺式作用元件较多的 ATG 上游 100 350 bp 序列进行诱饵载体的构建。基于目的片段序列设计上下游引物克隆目的片段，将目的片段与 pAbAi 载体连接，经PCR 检测后长度在 5 000 bp 以上，图 4 中泳道 1为 Kpn和 Xho双酶切质粒，泳道 2 为质粒DNA，1 显示长度正确，诱饵载体构建成功。2.5Y1H Gold 酵母菌株的转化将 pAbF35H-AbAi 与 pBait-AbAi 空载体经Bstb线性化后转入 Y1H Gold 感受态中，涂布于SD-Ura 培养基上，2 3 d 后取单克隆进行 PCR检测。空载体长度为 1 365 bp，阳性诱饵菌株的长度应大于 1 365 bp，如图 5，将长度正确的单克隆用于进一步实验。2.6最低 AbA 抑制浓度的筛选挑取诱饵载体菌株于 100 L 无菌水中，稀释不同倍数后分别涂于不同 AbA 浓度的 SD-Ura培养基上，生长结果如图 6 所示。转入空载的酵母菌株只能在无 AbA 培养基上生长，而诱饵载体图 3AbF35H 基因 CD-Search 分析Fig 3CD-Search of AbF35H gene表 2红苞凤梨 AbF35H 启动子顺式作用元件Table 2The cis-acting elements of AbF35H promoter of Ananas comosus var bracteatus顺式作用元件Cis-acting elements生物学功能Biological function出现次数Emergency timesTATA-box30 位置附近核心启动子转录起始位点 Transcription start point-30 core promoter element93RY-element种子特异性元件 Seed specific element1ABRE脱落酸响应元件 Abscisic acid response element8LTR低温响应元件 Low temperature response element3MYBMYB 结合位点 MYB binding site5AT1-motif光响应的部分元件 Some components that respond to light2CAAT-box启动子和增强子共同作用顺式元件 Regulatory elements for promoters and enhancers10Box 4光响应的保守 DNA 模块的一部分 Part of the conserved DNA module of the photoresponsive element2G-Box参与光响应顺式元件 Cis elements participating in photoresponse5TCA-element水杨酸响应元件 Salicylic acid response element3O2-site醇溶蛋白代谢调节元件 Cis-acting regulatory elements related to gliadin metabolism1GT1-motif光响应元件 Photoresponsive element2WUN-motif创伤反应元件 Wound response element1ARE厌氧响应元件 Anaerobic response element9circadian昼夜节律控制调节元件 Circadian rhythm control regulating element138林东璞，等 红苞凤梨 AbF35H 基因上游调控因子筛选1，Kpn和 Xho双酶切质粒;2，质粒 DNA;M，DL 5000marker。1，Plasmid digested by Kpn and Xho;2，DNA of plasmid;M，DL 5000 marker图 4诱饵载体序列凝胶电泳图Fig 4Gel electrophoresis of bait vector菌株在 SD-Ura/AbA(200 ng mL1)上仍能生长，说明诱饵载体菌株内启动子片段存在反式激活效应。诱饵载体菌株在 SD-Ura/AbA(250 ngmL1)培养基上不再生长，因此在单杂筛库过程中 AbA 质量浓度应在 250 280 ngmL1，本次筛库选择浓度为 260 ng mL1。泳道 1 4 为阳性克隆，5、6 为空载体对照。Lanes 1-4 were positive clones，and 5 and 6 were empty controls图 5Y1H 酵母菌株凝胶电泳图Fig 5Gel electrophoresis of Y1H yeast strain2.7酵母单杂筛库将 Y1H Gold(pAbF35H-AbAi)处理为感受态后加入10 g 酵母文库质粒与50 L 预变性的Carrier DNA，然后在 30 摇床中振荡培养 90min，涂布于 SD-Ura/AbA(260 ngmL1)培养基上，30 培养 3 5 d 后，选取阳性单克隆转移至相同培养基进行二次筛选，结果如图 7 所示。共筛选出 9 个单克隆，对单克隆进行酵母质粒抽提图 6最低 AbA 抑制浓度筛选结果Fig 6Screening results of minimum ABA inhibition concentration48浙江农业学报第 35 卷第 1 期图 7阳性单克隆二次筛选结果Fig 7Secondary screening results of positive monoclonal antibodies并扩增后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，并留一部分进行一对一验证。对测序结果进行 Blast 分析后发现，9 个克隆共编码 3 种不同的蛋白，分别为 BTB/POZ 锌指蛋白、GLOX-like乙二醛氧化酶、HSP81-1(heatshock protein 81-1)。2.8酵母单杂交互作验证对单杂筛库结果中的 3 种蛋白进行点对点单杂交互作验证，将单杂筛库过程中提取并测序成功的阳性酵母质粒分别用 Carrier DNA 转入Y1H Gold(pAbF35H-AbAi)感受态中，涂布于SD-Leu/AbA(260 ng mL1)培养基上，结果如图8 所示，使用空载体作对照，结果显示，筛出的 3个转录因子均能与 AbF35H 启动子结合产生AbA 抗性。图 8酵母单杂点对点验证结果Fig 8Yeast one-hybrid point-to-point verification results3讨论通过研究红苞凤梨不同颜色组织的花青素种类与含量，证明红苞凤梨的叶片、花瓣和苞片都可以合成积累全部 6 大类花青素，而各组织中不同种类花青素的相对含量不同，使各组织呈现出不同的红蓝颜色。花青素的种类组成和相对含量决定红苞凤梨组织红/蓝颜色的呈现，改变叶片花青素种类的相对含量就可以获得新的叶色种质材料，是红苞凤梨叶色育种的有效途径。在花青素的合成代谢途径中，二氢山奈酚分别在 F3H、DFR、F35H 作用下生成不同的中间物质，并进一步分别生成矢车菊素、天竺葵色素与飞燕草色素，其中 F35H 是蓝色飞燕草色素分支形成的关键基因，研究它的表达调控机制，可以为通过基因工程手段调控飞燕草素的相对含量，进而培育叶色新材料提供理论 基 础。AbF35H 基因编码的氨基酸 47 494 位都属于p450 超家族，该家族在有色类黄酮的生物合成中起着重要作用。黄烷酮、二氢黄酮醇、黄酮醇和黄酮的羟基化模式由 CYP75(p450 家族 75)蛋白质决定，通常花青素 B 环上羟基数量越多，花青素呈现颜色越蓝21 22，再一次验证了该基因与蓝色花青素积累密切相关。根据 AbF35H 启动子响应元件分析结果，推测 AbF35H 基因可能受到光、逆境、激素、花青素相关转录因子的诱导和调控，在此基础上通过酵母单杂交，筛选出AbF35H 上游的 3 个调控因子，分别为 BTB/POZ、GLOX-like、HSP81-1。BTB/POZ 锌指蛋白家族是一个超蛋白家族，该蛋白参与植物整个生长和发育过程，如向光性、抗逆性、细胞蛋白纤维网络构建等方面23。HE 等24 通过对可编码 BTB/POZ 蛋白的辣椒CaBPM4 基因的沉默研究发现，CaBPM4 沉默可以显著降低植物防御相关基因 CaPR1、CaDEF1和 CaSAR82 的转录水平，从而削弱植株对辣椒疫霉病的抗性。在大豆疫霉菌影响下，大豆 GmB-TB/POZ 转基因苗表现出更强的抗性，初步推断是该基因与水杨酸介导的植物防御机制存在正58林东璞，等 红苞凤梨 AbF35H 基因上游调控因子筛选反馈机制，同时 GmBTB/POZ 对 SOD、POD 两种抗氧化酶活性和表达具有积极的调节作用，通过提高大豆中抗氧化酶的活性为大豆提供足够的抗氧化保护，来提高植株对病菌的抗性25。乙二醛氧化酶是一种含铜酶，可以与过氧化物酶协同作用降解木质素。编码 GLOX 的基因广泛分布在降解木材的真菌中，目前在植物领域的 GLOX 研究中，已经检测到数种植物中存在GLOX/GLOX-like 编码基因，包括葡萄(Vitis vinif-era)(GenBank XP_002274763)、拟南芥(Arabi-dopsis thaliana)(GenBank NP _190963)和水稻(Oryza sativa)(GenBank ABF95066)等26 27。Zhou 等28 首先在中国野生葡萄(Vitis pseudonet-icta)中发现并验证了该基因功能，通过在已接种植物病原体的葡萄叶片中过表达该基因，发现GLOX 基因增强了植物的抗病性。乙二醛氧化酶可以与底物发生反应被氧化为羧酸，随后 O2充当共基质将 GLOX 还原为活性状态，同时生成H2O2，H2O2可以对病原体造成直接伤害，同时还能激活植物防御基因起到双重保护作用29。此外，植物过氧化物酶需要 H2O2来进行质外体结构蛋白连接和木质素聚合，从而在机械损伤后恢复细胞壁，增强对微生物酶攻击的抵抗能力30。联合启动子序列中的 WUN-motif 创伤响应元件分析初步推断机械损伤胁迫可能与 AbF35H 表达密切相关。热休克蛋白又称热激蛋白，是在高温环境下产生的蛋白质，根据其分子量不同可以分为HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、SHSP，其 中HSP81-1 属于 HSP90 蛋白，一般来说 HSP 蛋白可以通过分子伴侣作用使植物细胞具有更强的耐高温能力31，HSP 蛋白不仅与耐热性相关，同时也与植物的抗寒性相关。Shen 等32 通过对茶树高温与低温胁迫发现，不仅在高温诱导下 HSP90与 HSP70 表达量显著提高，低温下 HSP 基因的表达量同样显著升高，证明了 HSP 蛋白与植物抗寒性相关。此外，在 Shen 等32 的研究中，低温处理下茶树叶片中总花青素含量会显著提升，但高温下花青素的含量却会降低，结果与 Mori 等33 2007 年对葡萄果实高温下花青素含量测定的变化结果相同。花青素合成、HSP 蛋白表达均与温度相关。在启动子分析中发现，AbF35H 启动子含有3 个低温响应元件，因此推测 AbF35H 可能受到低温的调控，但与 HSP 蛋白的关系还需要进一步研究。BTB/POZ 锌指蛋白、乙二醛氧化酶和热激蛋白 81-1 对植物体本身有着增强抗逆性的作用。本课题组对红苞凤梨基因组数据的共表达分析表明，花青素生物合成途径的基因表达趋势往往与抗逆性基因表达呈正相关趋势(数据未发表)。此外，根据切片观察发现:红苞凤梨花青素在嵌合叶片的白色组织中的积累水平高于绿色组织34。白色组织中叶绿素 a、叶绿素 b、类胡萝素含量均显著低于绿色组织，嵌合叶片中白色组织的增多会导致叶片光合速率下降35，可以将白色组织中叶绿素的缺失作为一种光合胁迫，在这种胁迫下抗逆性基因表达量升高，花青素作为抗氧化物表达量也会进一步升高。在前期序列分析中，在启动子序列中分析出了 MYB 结合位点与 G-box，研究表明，G-box 可以作为 HY5 转录因子的结合位点36。MYB 转录因子家族是花青素生物合成途径中至关重要的一环。Shi 等37 对茄子 SmMYB75 的研究表明，过表达 SmMYB75 可以使茄子花青素积累显著升高，而且 F35H 表达量上升幅度远高于其他植物。此外，MYB 还可以与其他转录因子形成结合蛋白参与转录调控，如与 bHLH 结合对花青素合成进行调控38。HY5 是 bZIP 基因家族的成员，其功能丰富，不仅能够在植物光形态建成中起作用，在植物激素信号传递过程中也起到重要作用39，HY5 还能够调控花青素生物合成途径中的结构基因，HY5 蛋白在接收上游光信号后，通过直接激活下游结构基因或借其他方式间接调控下游花青素的积累。但在本次酵母单杂中并没有筛出 MYB 与 HY5 这 2 种在花青素生物合成途径中至关重要的转录因子，可能是因为酵母文库构建时选用材料主要为金边红苞凤梨的叶片组织，没有选用花瓣与苞片，而飞燕草素苷在叶片花青素中占比极低(1.91%)，AbF35H 在叶片中相对表达水平较低40，导致调控因子筛选不完全。在后续研究中可以通过以下 2 种方法完善研究内容:首先构建包含叶片、花瓣、苞片等不同组织的全新酵母杂交文库，进行重新筛库;其次可以通过构建目的转录因子如 AbHY5、AbMYB 的68浙江农业学报第 35 卷第 1 期猎物载体，与 AbF35H 诱饵载体进行酵母单杂交点对点验证，通过观察菌落生长情况判断是否存在调控机制，后续也可以通过双荧光素酶实验来进一步厘清 AbF35 H 与调控因子之间的关系。参考文献(References):1何业华，胡中沂，马均，等 凤梨类植物的种质资源与分类J 经济林研究，2009，27(3):102 107HE Y H，HU Z Y，MA J，et al Germplasm resources andtaxonomy of bromeliadJ Nonwood Forest Research，2009，27(3):102 107(in Chinese with English abstract)2张智，王炜勇，张飞，等 观赏凤梨种质资源及遗传育种研究进展J 植物遗传资源学报，2019，20(3):508 520ZHANG Z，WANG W Y，ZHANG F，et al Advances in re-search on genetic resources and breeding of ornamental brome-liads J Journal of Plant Genetic Resources，2019，20(3):508 520(in Chinese with English abstract)3何业华，方少秋，胡中沂，等 菠萝体细胞胚发育过程的形态学和解剖学研究J 园艺学报，2012，39(1):57 63HE Y H，FANG S Q，HU Z Y，et al Morphological and ana-tomical analysis of pineapple somatic embryogenes