白术内酯Ⅱ逆转M2型巨噬细胞极化调控PDL1表达抑制A549细胞迁移.pdf
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1、天然产物研究与开发NatProdResDev2023,35:1857-1863白术内酯逆转M2型巨噬细胞极化调控PDL1表达抑制A549细胞迁移蒋宗荃,赵云辉,张云亭,郑辽宁中医药大学中西医结合学院,沈阳110 8 47摘要:探究白术内酯I(a t r a c t y l e n o l i d e II,A T-II)对M2型巨噬细胞极化与A549细胞迁移能力的影响,并分析其潜在机制。利用PMA将THP-1细胞诱导成MO巨噬细胞,然后加人IL-4和IL-13继续诱导为M2型巨噬细胞。利用Transwell 小室将M2型巨噬细胞与A549细胞共培养,分别给予0、2.5、5mol/L的AT-I进
2、行作用。采用MTT实验测定共培养条件下AT-II对A549细胞活力的影响;采用Real-timePCR检测M2型巨噬细胞Arg-1的mRNA表达水平;采用ELISA检测共培养体系中TNF-、IL-1的含量;采用WB检测A549细胞TLR4、P-p 6 5、NF-k B(p 6 5)、PD L1的蛋白表达水平;采用划痕实验检测A549细胞的迁移能力。结果显示,共培养条件下,与对照组相比,实验组(2.5、5mol/L)A549细胞活力降低(2.5mol/L组P0.05、5mol/L组P0.01);M 2 型巨噬细胞特异性基因Arg-1的mRNA表达水平显著降低(P0.05);A 549细胞TLR4
3、/NF-kB信号通路相关蛋白TLR4、P-p 6 5、NF-k B(p 6 5)蛋白表达水平降低(P0.01);A549细胞PDL1蛋白表达水平显著降低(P0.05),5 mol/L group(P0.01);The mRNA expression level of M2 macro-phage specific gene Arg-1 was significantly reduced(P0.05);The expression levels of TLR4,P-p65收稿日期:2 0 2 3-0 4-12基金项目:国家自然科学基金青年基金(8 12 0 2 7 8 9);辽宁省自然科学基金指
4、导计划(2 0 19-ZD-0950);辽宁省教育厅一般项目(LJKM20221311)*通信作者Tel:86-015940157054;E-mail:了一,王建光,刘羽茜,王艳杰文章编号:10 0 1-6 8 8 0(2 0 2 3)11-18 57-0 7接受日期:2 0 2 3-0 6-2 51858and NF-kB(p65)proteins related to the TLR4/NF-kB signaling pathway decreased in A549 cells(P0.01);The expres-sion of PDL1 protein in A549 cells si
5、gnificantly decreased(P0.01),and the ability of A549 cells migration decreased.These results indicate that AT-II can reverse the polarization of M2 macrophages,inhibit NF-kB signaling pathway in A549cells and reduce the expression level of PDL1,thus inhibiting the migration of lung cancer cells.Key
6、words:atractylenolide II;A549 cells;M2 macrophages;PDL1 protein肺癌是常见的恶性肿瘤,威胁着人类的健康,是公共卫生面临的一项重大难题。据CLOBOCAN2020年数据和世界卫生组织世界人口前景分析,2022年肺癌仍是我国发生率和死亡率最高的肿瘤1。在肿瘤微环境中,发挥免疫效用的巨噬细胞多表达为M2型,多项实验结果显示M2型巨噬细胞促进肿瘤细胞增殖与迁移,并与肿瘤耐药呈正相关性2.3。肺癌早期M1 型巨噬细胞高表达,而中晚期巨噬细胞更倾向于表达M2型4。巨噬细胞具有较强的可塑性,并且 M1 型巨噬细胞比率与生存率增加呈正相关,这让阻断
7、M2型极化或促进M2型复极为M1 型策略具有吸引力,为肿瘤免疫治疗提供了重要研究方向5。“培土生金法”在治疗肺癌中取得良好成效,本课题组前期发现四君子汤、参苓白术散等培土生金中药复方可以有效抑制肺癌增殖6.7 。白术内酯I(a t r a c t y l e n o l i d e II,A T-II)是培土生金中药复方中白术里提取的倍半枯单体,在多种肿瘤中具有抗肿瘤活性-0 。AT-可以通过诱导调亡来阻碍肿瘤进展,但其是否可以通过调控免疫,对肿瘤细胞与巨噬细胞间的相互作用产生影响尚不明确,故本文针对AT-对共培养体系下肺癌细胞的免疫调控进行了初步探讨。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株T
8、HP-1 细胞、A549 细胞,购自武汉普诺赛生命科技有限公司(CL-0233、CL-0 0 16)。1.1.2试剂胎牛血清(四季青,批号19110 50 2);RPMI-1640培养基(普诺赛,货号PM150110B);M T T 试剂(碧云天,货号C0009);PM A(So l a r b i o,货号P6741);RNaseinhibitor(Bi o T e k e,货号RP5602);RIPA 裂解液(So-larbio,货号 R0010)。1.2方法1.2.1M2型巨噬细胞诱导参照课题组前期的实验方法11,用PMA、IL-4与IL-13将 THP-1 细胞诱导分化为M2 巨噬细胞
9、。天然产物研究与开发待其密度达到90%按1:2 进行传代。1.2.2共培养模型建立利用Transwell小室,模拟体内肿瘤微环境12 ,将种有M2型巨噬细胞的小室嵌入含A549细胞的96孔板中共同培养。1.2.3MTT实验测定A549细胞活力根据课题组前期实验摸索发现2.5、5mol/LAT-I 单独作用巨噬细胞与A549细胞48 h对其细胞活力无影响。构建共培养体系,检测2.5、5mol/LAT-II对共培养条件下肺癌细胞活力的影响。A549细胞消化离心后,重悬计数,按410 3个/孔接种于96 孔板,设置五个复孔,待其贴壁。将接种不同浓度AT-孵育的M2 型巨噬细胞的小室嵌人96 孔板中,
10、共培养48 h。然后更换为含MTT的培养基,在37 下孵育4 h。去上清,加人DM-SO,放入酶标仪,读取57 0 nm处OD值,根据实验组与对照组(control,Con)的 OD 比值计算细胞存活率:细胞存活率=(OD对照组0D 空白组)10 0%。1.2.4Real-time PCR 实验检测 Arg-1 的mRNA 表达水平每组设置三个复孔,0、2.5、5mol/LAT-作用后提取M2型巨噬细胞,与裂解液混匀静置后,加人氯仿,震荡15s后放置于室温下3min。410 0 0 0g离心10 min,将得到的透明水相与无水乙醇按2:1混匀,转人吸附柱离心后,弃废液。加人去蛋白液离心30 s
11、后,用漂洗液清洗。最后向装有吸附柱的离心管中加入不含RNA酶ddH,O,4离心得到总RNA。对所得样本进行浓度测定后进行反转录,即将含有模板 RNA、引物、Reaction Buffer、RNa s e In-hibitor、d NT PM i x、M-M LV 反转录酶的反应体系放人PCR仪中。将得到的cDNA模板、上下游引物(Arg-1 上游:CATAGGGATTATTGGAGC,A r g-1下游:TCATTAGGGATGTCAGCA;GAPDH 上 游:GACCT-GACCTGCCGTCTAG,GAPDH 下游:AGGAGTGGGT-GTCGCTGT)、SYBR G REEN与Mast
12、erMix放人荧光定量仪进行扩增处理。最后进行数据分析,根据溶Vol.35D实验组-OD空白组)/(OD,Vol.35解曲线判定扩增数据是否可用,若可用则根据2-Ac值来判断表达量。1.2.5ELISA实验检测 TNF-和IL-1含量取共培养体系中的上清,离心去除沉淀物。按照试剂盒说明书稀释标准品与抗体。在加样前,用洗液洗板以使包被抗体保持最佳活性,按照每孔100 L进行加样,加人抗体后封膜。室温振荡孵育1.5h后,弃液,漂洗。再向孔中加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素,封膜孵育 30 min 后再洗涤 6蒋宗釜等:白术内酯逆转M2型巨噬细胞极化调控PDL1表达抑制A549细胞迁移*100-5
13、0-02.5,umo/L5.umoi/L1859150-次。最后再加人TMB避光静置2 0 min后终止反应,放人酶标仪进行检测。将校准的OD值(450 nm的测定值减去57 0 nm的测定值)带人绘制的标准曲线计算出各组上清中TNF-、IL-1炎性因子含量。1.2.6Western blot 实验检测 TLR4、P-p 6 5、NF-k B(p 6 5)、PD L1的蛋白表达水平提取A549细胞,按照试剂盒指示提取总蛋白,采用BCA法进行蛋白质定量。将稀释的样品进行煮沸变性,制成上样液。将上样液按每孔2 0 L注人胶槽中,进行电泳。电泳结束后按照“三明治”法转膜封闭。完成后再将 PVDF膜用
14、一抗4孵育。清洗4次后再将其放人二抗中孵育1h,清洗后转入暗盒,洒匀发光液进行曝光。记录条带的光密度值,计算目的蛋白与内参的比值,用于后续分析。1.2.7划痕实验检测A549细胞迁移能力铺板前在六孔板底背面画三条平行线,将对数图1AT-II对共培养条件下A549细胞活力的影响Fig.1 Effect of AT-II on cell viability of A549 in co-culture注:*P0.05,*P0.01,下同。Note:*P0.05,*P0.01,the same below.Con组相比,2.5、5 mol/L组Arg-1表达明显降低,具有统计学差异(P0.05),5m
15、ol/L组(0.7 44 0.111)细胞活力明显下降,具有统计学差异(P0.05)。5 mol/L组与1860Con组相比有增多趋势但未构成显著差异(P天然产物研究与开发0.05)(见图 4)。150-Vol.35150100-100-50-50-00Con5.umol/L5.umo/L2.5 umo/L图4AT-II对上清中TNF-、IL-1含量的影响Fig.4Effect of AT-II on TNF-,IL-1 content in supernatant2.4AT-II 对 A549 细胞 TLR4、P-p 6 5、NF-k B(p 6 5)、PD L1的蛋白表达水平的影响通过条带
16、宽度及目的蛋白与内参的灰度比值可以看出 AT-II明显抑制A549细胞表面 TLR4蛋白的表达,显著降低 p-p65、NF-k B 与PDL1 蛋白的表达(P0.05),48 h 后与Con组相比,2.5mol/L与5 mol/L组细胞的边缘距离明显增大(P0.01)(见图6)。Con2.5mol/L5mol/LTLR4Con2.5mol/L5mol/L95kDaP-p6565kDaGAPDHNF-xBp65HistoneH336kDaCon2.5mol/L5mol/L65kDa15kDaGAPDHPDL1GAPDH36kDaCon 2.5 mol/L5 mol/L43kDa36kDa图5AT
17、-II对A549细胞TLR4、P-p 6 5、NF-k Bp 6 5、PD L1蛋白表达的影响Fig.51Effect of AT-II on the expression of TLR4,p-p65,NF-kB p65 and PDL1 in A549 cells表1AT-II对A549细胞TLR4、P-p 6 5、NF-k B(p 6 5)、PD L1蛋白灰度比值的影响(xs,n=3)Table 1Effect of AT-II on the gray ratio of TLR4,p-p65,NF-kB(p65),PDL1 proteins in A549 cells(x s,n=3)组别
18、 GroupCon2.5 mol/L5 mol/L注:与Con组比较,*P0.01。Note:Compared with Con,*P0.01.3讨论与结论肺癌是癌症致死的头号原因,发病初期病情隐TLR41.072 0.0030.789 0.002*0.505 0.001*P-p650.885 0.0040.756 0.005*0.729 0.001*NF-kB p650.949 0.0010.967 0.001*0.738 0.001*匿,容易错过最佳治疗时机13。邪之所凑其气必虚,中医认为癌瘤为标,正虚为本,正虚乃成岩。PDL11.035 0.0020.927 0.004*0.754 0.
19、003*Vol.35“培土生金法”是五行相生理论的实践化,是“虚则补其母”的具体化。肺癌虽病位在肺,但课题组前期证明“培土生金法”可以通过调理脾脏达到抑制肺癌进展的效果。同时大量实验结果也表明参苓白术散14,15、四君子汤16,17 、健脾益肺方18 均可以调补脾胃,从而抑制肺癌生长。白术是上述复方中的共有药物,是补脾益气药的代表,其主要药效成分为白术内酯、苍术酮。苍术酮在加热、炮制后含量会明显下降,因此白术内酯成为白术中药煎剂的主要作蒋宗签等:白术内酯逆转M2型巨噬细胞极化调控PDL1表达抑制A549细胞迁移1861用成分。以往药理研究发现白术具有抗肿瘤作用,并且无明显机体毒性。AT-I是白
20、术中提取的一种倍半单体,已证实对多种肿瘤起到抑制作用。中华中医药学会指出中医药学与免疫学相结合有益于阐明中医药调节机体免疫的机理,为中医药临床有效性提供依据。2 0 18 年诺贝尔得者詹姆斯艾利森与庶佑提出通过调动自身免疫能力来攻击癌症的全新观念,印证了“扶正治癌”理论。在肿瘤微环境中,巨噬细胞被招募至微环境中活化成肿瘤0h48 hCon1100-1050-1000-王士950-士900Con2.5 mol/L600500-400-300Con5 mol/L厂*2.5 mol/L5.mol/L2.5mol/L5.umol/L图6 AT-II 对A549细胞迁移能力的影响Fig.6Effect
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