低剂量PFOS暴露干扰睾丸类固醇激素合成的分子机制研究.pdf
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1、中国环境科学 2023,43(8):43264333 China Environmental Science 陈海滨,华炜桢,黄清育.低剂量 PFOS 暴露干扰睾丸类固醇激素合成的分子机制研究 J.中国环境科学,2023,43(8):4326-4333.Chen H B,Hua W Z,Huang Q Y.Study of the molecular mechanism of low-dose PFOS exposure-induced testicular steroidogenesis disturbance J.China Environmental Science,2023,43(8)
2、:4326-4333.低剂量 PFOS 暴露干扰睾丸类固醇激素合成的分子机制研究 陈海滨1,华炜桢2,3,黄清育2*(1.厦门市食品药品质量检验研究院,福建 厦门 361012;2.中国科学院城市环境研究所,城市环境与健康重点实验室,福建 厦门 361021;3.福建医科大学公共卫生学院卫生检验与检疫学系,福建 福州 350122)摘要:利用蛋白质组学技术分析了 0.015,0.15,1.5mg/kg 的 PFOS 暴露 2 个月后,大鼠睾丸蛋白质组的差异表达谱.结果显示,PFOS 暴露后大鼠血清中孕酮和睾酮的水平均显著上升,并且睾丸组织中56种蛋白质的表达水平发生了显著改变.其中,有10种差
3、异表达蛋白与脂肪酸代谢及睾丸类固醇激素合成密切相关(9 种蛋白表达上调,1 种表达下调).大部分脂肪酸代谢相关蛋白与睾丸类固醇激素合成相关蛋白在统计学和生物学上均具有显著的相关性.低剂量 PFOS 暴露可通过加速睾丸中的脂肪酸代谢及类固醇激素合成进程,促进孕酮和睾酮等类固醇激素的合成与分泌,提示普通环境 PFOS 暴露的男性生殖健康风险.关键词:全氟辛烷磺酸;低剂量暴露;蛋白质组学;睾丸类固醇激素合成;脂肪酸代谢 中图分类号:X503 文献标识码:A 文章编号:1000-6923(2023)08-4326-08 Study of the molecular mechanism of low-d
4、ose PFOS exposure-induced testicular steroidogenesis disturbance.CHEN Hai-bin1,HUA Wei-zhen2,3,HUANG Qing-yu2*(1.Xiamen Institute for Food and Drug Control,Xiamen 361012,China;2.Key Laboratory of Urban Environment and Health,Institute of Urban Environment,Chinese Academy of Sciences,Xiamen 361021,Ch
5、ina;3.Department of Health Inspection and Quarantine,School of Public Health,Fujian Medical University,Fuzhou 350122,China).China Environmental Science,2023,43(8):43264333 Abstract:Proteomic technique was employed to analyze the differential expression profile of rat testicular proteome after exposu
6、re to 0.015,0.15 and 1.5mg/kg of PFOS for two months.The results showed that the progesterone and testosterone levels in rat serum were significantly increased,and the expressions of 56 proteins in testis tissue were significantly altered after PFOS exposure.Among them,10 differentially expressed pr
7、oteins(DEPs)were closely related to fatty acid metabolism and testicular steroidogenesis(9proteins were up-regulated and 1was down-regulated).In addition,most fatty acid metabolism-related DEPs were statistically and biologically correlated with steroidogenesis-related DEPs.These results indicate th
8、at low-dose PFOS can accelerate fatty acid metabolism and steroidogenic process in rat testis,ultimately stimulating the synthesis of steroid hormones,progesterone and testosterone.This study can provide new clues to the toxicological mechanism of testicular steroidogenesis disturbance induced by lo
9、w-dose PFOS exposure,and implicate the male reproductive health risk of humans environmentally exposed to PFOS.Key words:perfluorooctune sulfonate(PFOS);low-dose exposure;proteomics;testicular steroidogenesis;fatty acid metabolism 全氟烷基化合物(PFASs)是一类具有强碳-氟键结合作用的人造化合物1.全氟辛烷磺酸(PFOS)是一种典型的 PFASs,被广泛应用于表面
10、活性剂、润滑剂、油漆、抛光剂、纸张和纺织品涂料、食品包装和阻燃泡沫等相关产业2.由于其大量使用且在自然条件下难以降解,在空气、水、沉积物、动植物中均已检测出了 PFOS,并将其归类为新兴持久性有机污染物(POPs)3-8.PFOS 在生物体中不易降解,因而可在体内不断蓄积9,从而导致包括雄性生殖毒性在内的一系列生物毒性10-12.睾丸类固醇激素合成机制是调节男性生殖系统中雄性激素产生与分泌的重要途径,对男性生殖具有极其重要的作用.睾丸间质细胞内的类固醇激素合成通路起始于 StAR 将胆固醇转运至线粒体内膜并在 CYP11A1 的催化下转化为孕烯醇酮,再经由3-HSD、CYP17A1 和 17-
11、HSD 等相关酶的作用合成睾酮等类固醇激素13.因此,通路中类固醇激素合成相关蛋白(或酶)的表达异常往往导致激素的合成与分泌紊乱14.研究表明 PFOS 是一种内分泌干扰物,可干扰雄性生殖内分泌15.已有研究显示,高剂量 收稿日期:2023-01-16 基金项目:国家自然科学基金资助项目(22076179,21677142);福建省自然科学基金资助项目(2022J06033);厦门市青年创新基金资助项目(3502Z20206091)*责任作者,研究员, 8 期 陈海滨等:低剂量 PFOS 暴露干扰睾丸类固醇激素合成的分子机制研究 4327 PFOS 暴露抑制了 Star、Cyp11a1、Cyp
12、17a、Hsd3b1等类固醇激素合成相关基因的表达水平,从而降低睾丸细胞中的睾酮水平16.此外,PFOS 暴露后大鼠睾丸间质细胞中 CYP11A1,CYP17A1 和 17-HSD3表达下调,血清睾酮水平降低17.与此相反,低剂量PFOS 可通过激活睾丸中 StAR、CYP11A1 和3-HSD 的表达,并提高大鼠的类固醇激素(孕酮和睾酮)合成水平15.人群研究也表明宫内 PFOS 暴露会导致新生儿脐带血中的类固醇激素水平升高18.但上述研究仅聚焦 PFOS 通过影响睾丸类固醇激素合成通路而干扰激素合成,PFOS 是否可经由其他机制影响类固醇激素合成与分泌仍鲜有研究.蛋白质是生命活动的直接执行
13、者,其活性或含量的变化可反映机体对于内外环境刺激的生物学响应19.蛋白质组学技术可从整体水平上分析蛋白质的表达信息,因而是发现环境污染物的毒理学机制及新标志物的强有力手段20.目前,虽然有部分研究利用蛋白质组学技术分析了 PFOS 暴露的毒性机制,但大多关注 PFOS 对鳃、肝脏、血细胞及胚胎干细胞蛋白质组的影响,并且多为急性(114d)和高剂量暴露(30300mg/kg)21-24.通过分析睾丸蛋白质组研究低剂量 PFOS 暴露干扰类固醇激素合成的分子机制尚未见报道.本研究通过分析长期低剂量 PFOS 暴露对雄性大鼠血清中类固醇激素水平,及睾丸蛋白质组表达的影响,旨在揭示PFOS干扰雄性生殖
14、内分泌的新机制,从而为环境PFOS暴露的男性生殖健康风险评估与预防策略提供科学依据.1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 Eppendrof 5810R 高速离心机(美国 Thermo 公司);Waters nanoACQUITY 超高效液相色谱仪(美国Waters 公司);Q Exactive 质谱仪(美国 Thermo 公司);nanoACQUITY UPLC 2G-VIMTrap C18 色谱柱(5m,20mm180m i.d.,美 国 Waters 公 司);nanoACQUITY UPLC BEH130C18 色谱柱(1.7m,100mm100m i.d,美国 Waters 公司);P
15、FOS(美国Sigma-Aldrich 公司).1.2 动物分组及 PFOS 暴露 40只雄性Wistar大鼠(10周龄)购自厦门大学实验动物中心.实验期间,所有大鼠均在(23 2)的室温和(45%10%)的相对湿度,以及 12/12h 的光/暗循环条件下饲养,并自由摄取食物和饮水.适应性饲养一周后,将其随机分为 4 组(n=10/组).暴露组大鼠通过灌胃给予 0.015,0.15,1.5mg/(kgd)的 PFOS,对照组以玉米油灌胃,连续暴露 60d.数据显示,世界普通人群血清中 PFOS 的平均浓度范围为 1.7 73.2ng/mL(相当于g/kg)25.根据大鼠与人类的剂量转换标准26
16、,本研究中大鼠 PFOS 暴露的低、中剂量(即 15 和 150g/kg),相当于人类的 2.5 和 25g/kg,均处于普通人群的PFOS暴露水平范围内,从而被认为是环境相关剂量.1.5mg/kg 暴露剂量则高于普通人群血清中的PFOS平均浓度,处于职业人群的暴露水平范围内(0.142.44g/mL)25.暴露结束后,处死大鼠,收集血清和睾丸组织,并储存于液氮中.动物实验方案得到中国科学院城市环境研究所伦理审查委员会批准.1.3 血清类固醇激素测定 使用类固醇激素检测试剂盒(德国 Siemens Healthcare 公司),通过放射免疫法测定血清类固醇激素(孕酮和睾酮)水平27-28.大鼠
17、血清在分析前解冻,放射免疫试管中分别加入孕酮、睾酮标准抗原或血清样品,125I 标记抗原、抗体,在 37下分别孵育2.5,1.5,0.5 和 1h.待免疫反应达到平衡后,4离心(3600r/min)20min弃上清,用1470型计数器分别测量各反应管沉淀物的放射性计数(cpm).1.4 睾丸 PFOS 含量分析 取50mg睾丸组织在水中进行匀浆,并在室温下加入内标(PFOS 13C)平衡过夜.之后加入0.5mol/L四丁基硫酸氢铵(TBA)、0.25mol/L Na2CO3和 100%甲基叔丁基醚(MTBE)混合均匀.样品经 3000r/min 离心 15min后,收集上清液.重复上述提取过程
18、两次后,将所有上清液合并、干燥,并使用 50%甲醇重溶后进行液相色谱-质谱(LC-MS/MS)分析27,该方法对于PFOS 的最低检出限为 0.14g/L,定量限为 0.47g/L.使用同样的方法同时对质控样品和标准样品进行分析.1.5 蛋白质组学样品制备 取 100mg 大鼠睾丸组织置于提取缓冲液(50mmol/L Tris,0.1%SDS,10mmol/L HEPES,pH 8.1)中匀浆.在冰上孵育 30min 后,12000g 离心15min 以去除未溶解的组织碎片,再用三氯乙酸/丙4328 中 国 环 境 科 学 43 卷 酮沉淀蛋白提取物,-20保存过夜.12000g 离心30mi
19、n 后去上清,用裂解缓冲液(6mol/L 尿素,2mol/L硫脲,20mmol/L DTT,30mmol/L Tris,0.1%SDS)重悬蛋白质沉淀.样品经12000g离心30min后收集上清液(即总蛋白),使用 BCA 方法测定蛋白浓度.取 50g 蛋白质样品,分别加入 10mmol/L 二硫苏糖醇和 40mmol/L 碘乙酰胺进行还原和烷基化.样品按 1:50(w/w)添加胰酶,并于 37空气浴中酶解过夜.酶解得到的多肽样品经 C18ZipTips 脱盐后进行nano-LC/MS/MS 分析.1.6 nano-LC/MS/MS 分析 利用 Waters nanoACQUITY UPLC
20、串联 Q Exactive 质谱仪进行蛋白质组分析.色谱条件:流动相为A:98%乙腈(含0.1%甲酸);B:2%乙腈(含0.1%甲酸).洗脱程序为:0min,3%A;25min,8%A;135min,35%A;145min,65%A;180min,100%A.流速为0.3L/min,进样量为 5L.质谱条件:电喷雾离子源(ESI),Full MS 分辨率为70000,扫描范围为 3501800m/z.AGC(automatic gain control)target设置为1106,允许最大进样时间为50ms,并选择强度最高的 15 个肽段进一步碎片化.MS/MS分辨率为 17500,AGC t
21、arget 为 1105,最大进样时间为100ms.前体选择的荷质比窗口设为 2.0m/z.高能碰撞诱导解离碎片化的碰撞能量设为 28%.1.7 蛋白质组学数据分析 将 LC-MS/MS 数 据 导 入 MaxQuant 软 件(http:/maxquant.org/,version 1.5.7.0)进行蛋白质鉴定和定量分析.使用 Uniprot-SwissProt 大鼠蛋白数据库进行蛋白质鉴定.MaxQuant参数设置如下:固定修 饰 为carbamidomethylation(C),可 变 修 饰 为oxidation(M)和 acetylation(N 端).肽段修饰的最大数量设置为 5
22、.胰蛋白酶(P)酶切,漏切最大数量为 2.肽段和蛋白质的错误发现率(FDR)设置为 0.01.使用LFQ(Label-free quantification)算法进行蛋白定量.利用String数据库(https:/cn.string-db.org/)分析蛋白之间的相互作用.1.8 统计学分析 利用 SPSS 软件(22.0 版本)对数据进行统计学分析.使用单因素方差分析(ANOVA)和 LSD 检验计算组间差异的显著性;利用 Pearson 相关分析蛋白之间的相关性;P0.05 为差异有统计学意义.2 结果与分析 2.1 PFOS 在大鼠睾丸组织中的蓄积 采用液相色谱-质谱联用技术测定大鼠睾丸
23、组织中的 PFOS 浓度.结果显示,随着暴露剂量的升高,大鼠睾丸中 PFOS 的浓度分别为 0.03,0.74,2.48,5.65g/g(图 1).与对照组相比,PFOS 暴露后睾丸中PFOS 含量显著升高,并呈良好的剂量效应关系.该结果表明,长期低剂量暴露后,PFOS 可在睾丸组织内蓄积,从而可能损害大鼠睾丸功能,为后续研究PFOS 的雄性生殖毒性提供了可靠的依据.图 1 暴露后大鼠睾丸组织中的 PFOS 浓度 Fig.1 PFOS concentrations in rat testis after exposure*P0.01(与对照组比较)2.2 PFOS暴露提高大鼠血清中的类固醇激素
24、水平 图 2 PFOS 暴露对大鼠血清中孕酮和睾酮水平的影响 Fig.2 Effects of PFOS exposure on progesterone and testosterone levels in rat serum*P0.05,*P0.01(与对照组比较)为分析 PFOS 暴露对类固醇激素合成的影响,检8 期 陈海滨等:低剂量 PFOS 暴露干扰睾丸类固醇激素合成的分子机制研究 4329 测 了 大 鼠 血 清 中 孕 酮(Progesterone)和 睾 酮(Testosterone)的水平.结果显示在不同浓度 PFOS 暴露后,大鼠血清中的类固醇激素水平与对照组相比均显著升高
25、.随着暴露剂量的增大,孕酮浓度分别为 10.91,18.73,16.16,17.88nmol/L,睾酮浓度分别为 9.11,33.82,24.04,14.07nmol/L(图 2).该结果表明,低剂量 PFOS 暴露促进了大鼠睾丸类固醇激素的合成与分泌.2.3 PFOS 暴露影响大鼠睾丸蛋白质组的表达 采用非标记定量蛋白质组学技术分析 PFOS 暴露后,大鼠睾丸中蛋白质组的表达变化.MaxQuant 软件分析总共鉴定出 2304 种蛋白质,其中 1205 种蛋白质在所有样品中得到定量.分析这些蛋白质在各组中的相对表达量,与对照组相比,大部分蛋白质的表达水平在 PFOS 暴露后并未发生明显变化,
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