丁香酚酯及肉桂醇酯对氟比洛芬透皮吸收的影响.pdf
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1、2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 丁香酚酯及肉桂醇酯对氟比洛芬透皮吸收的影响王晶1,张金伟1,张艺蓉1,万旭春1,尹虹1,李翰铭1,赵利刚1,2(1.华北理工大学药学院 唐山 063210;2.唐山市新型药物制剂与释药技术重点实验室 唐山 063210)摘要:目的通过对芳香族挥发油中的肉桂醇(CIN)、丁香酚(EUG)成分进行结构改造,寻找促透效果更好且安全性高的经皮给药促透剂。方法以CI
2、N、EUG为先导化合物,采用酰氯酯化法合成硬脂酸肉桂醇酯(CIN-C18)和硬脂酸丁香酚酯(EUG-C18),通过体外经皮渗透实验、体外释放实验、分子模拟技术和红外光谱法初步探究其促透机制。结果以EUG-C18为促透剂时,FP的24h经皮累积透过量(Q24h)可达到(295.0345.08)gcm-2,与其他组相比较,均有显著的促透效果(P98%。CIN-C18:1H-NMR(600 MHz,CDCl3):7.48-7.40(6H,m),7.36(6H,dd,J=8.4,6.8 Hz),7.34-7.27(5H,m),6.69(3H,d,J=15.6 Hz),6.35(3H,dt,J=15.7
3、,7.2 Hz,),4.28(6H,dd,J=7.2,1.2 Hz,),7.61-0.70(10H,m),1.28(4H,s),0.91(1H,t,J=6.9 Hz).产率:76.5%。EUG-C18:1H-NMR(600 MHz,CDCl3):7.05-6.69(3H,m),5.98(1H,ddt,J=16.9,10.1,6.7 Hz),5.25-4.86(2H,m),4.15(3H,q,J=7.2 Hz),3.83(4H,s),3.40(2H,dd,J=6.7,1.6 Hz),2.58(2H,t,J=7.5 Hz),2.31(4H,t,J=7.5 Hz),1.90-1.70(3H,m),1
4、.65(4H,q,J=7.4 Hz),1.44-1.37(2H,m),1.36-1.11(12H,m),0.90(4H,t,J=7.0 Hz)。产率:77.4%。2.2体外分析方法的建立及方法学考察2.2.1色谱条件Hypersi ODS 色谱柱(4.6 mm150 mm,5 mm);流动相:甲醇-含1%冰乙酸的水溶液(55:45,v/v);检测波长:247 nm;柱温 40;流速:1.0 mLmin-1;内标为40 gmL-1尼泊金异丙酯溶液。2.2.2标准曲线方程精密称量20.01 mg的FP于容量瓶中,加入甲醇定容,稀释至200 gmL-1,再稀释为浓度为0.2-100 gmL-1的FP
5、溶液。分别加入等体积、浓度为40 gmL-1尼泊金异丙酯溶液。以尼泊金异丙酯为内标物,通过HPLC进行溶液检测,分析药物与内标的峰面积比值(Ai)随模型药物的不同浓度(C)的变化曲线。对数据进行线性拟合,得到回归方程:Ai=0.0304C+0.0046,r=0.9999。证明在0.2-100 gmL-1范围内,二者具有良C17H35COOHSOCl2C17H35COClOC17H35O123456789OHOHOCH3OCH3OC17H35O123456(a)(b)(c)(d)图1CIN-C18、EUG-C18的合成路线注:a:CIN;b:EUG;c:CIN-C18;d:EUG-C18。179
6、7 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 好的线性相关性。2.2.3精密度日内精密度测定需在1天时间内对高、中、低3个浓度下的样品进行分析,日间精密度测定选用相同浓度样品连续3天进样分析,得到3种浓度的日内精密度均值分别为 RSD:(0.980.13)%、(0.910.19)%和(1.120.37)%(n=6),日间精密度均值分别为 RSD:(0.950.17)%、(0.980.29)%和(1
7、.030.41)%(n=6)。2.2.4回收率通过计算高、中、低三种药物浓度的比来确定回收率,得到FP平均加样回收率分别为(97.860.52)%、(98.360.36)%和(99.030.23)%(n=6)。2.3体外透皮实验2.3.1离体兔皮的制备选取体质量(2000200)g的家兔,以质量浓度为20%的乌来糖溶液作为麻醉剂,将其背部朝上固定于兔台,用修剪器除去背部长毛后,用剃须刀除去细密绒毛。待皮肤裸露后,采用空气栓塞法处死大耳兔。之后,迅速剥离背部皮肤,剔除皮肤中的脂肪和结缔组织,裁剪成1cm2,于生理盐水下冲洗数次,之后置于密封袋中低温(-80)冷冻保存。兔皮须在7天内使用,使用前应
8、当保证其完整无破损。2.3.2贴剂的制备称取FP溶于乙酸乙酯溶液中,与促透剂、压敏胶混合,置于磁力搅拌器上搅拌15 min至混匀,静置脱气10 min直至气泡消失,将混合物均匀转移到硅酮纸上,室温下放置 10 min 挥发溶剂,于 50下烘干15 min,覆上背衬膜备用。同上制备含有促透剂(挥发油及其酯)的 FP 贴剂,处方中 FP、压敏胶(DURO-TAK 87-235A)的比例保持不变。2.3.3体外渗透实验方法采用水平卧式双室扩散池为实验装置,以离体兔皮为透过屏障,在其角质层一侧贴敷制备好含(不含)促透剂的贴剂,加入3.5 mL pH=7.4的PBS溶液,加入磁转子,32下恒温搅拌。于2
9、、4、6、8、10、12、24 h取样2 mL,同时补充2 mL PBS溶液。在4,4000 rmin-1条件下离心5 min,取300 L上清液与等量内标液混匀,经高效液相色谱仪分析测定含量。计算单位面积累积透过量(Q)。以Q对时间t作图,直线的斜率为稳态透皮速率(Jss),直线与横轴的交点为时滞(tlag),并计算增渗比(ER,即加入促透剂与不加促透剂时药物Q24h之比)2.4体外释放实验选择FP贴剂(含或不含促透剂)进行药物释放度测定。在(320.5)下进行实验,取磷酸盐缓冲溶液(900 mL)注入溶出杯中,将贴剂释放面朝上固定于碟网之间,并与桨底相距(252)mm 处平行放置13,于0
10、.5、1、2、4、6、8、10、12、24 h取样5 mL,同时补充5 mL缓冲溶液。样品经微孔滤膜(0.45 m)过滤后在室温下4000 rmin-1下离心5 min,与同体积内标液混合,涡旋20 s,通过HPLC检测。2.5分子模拟Materials Studio 7.0软件用于模拟促透剂-模型药物-神 经 酰 胺 三 者 之 间 相 互 作 用 的 影 响。从ChemDraw 16.0 中 获 得 模 型 药 物(FP)、神 经 酰 胺0481216202428050100150200250300350400Time(h)Q24(g/cm2)None1%CIN3%CIN5%CIN(A)0
11、481216202428050100150200Time(h)Q24(g/cm2)None3%EUG1%EUG5%EUG(B)图2含有不同浓度挥发油的贴剂中FP的经皮渗透曲线(x s,n=4)注:A:CIN;B:EUG。表1挥发油及其硬脂酸酯对FP的经皮渗透影响(x s,n=4)促透剂ControlCINEUGCIN-C18EUG-C18Jss(gcm2h-1)6.070.8911.661.268.421.2412.181.3212.811.88Q24h(gcm-2)106.528.35205.0429.28*161.5725.17*254.5233.27*295.0345.08*tlag/(
12、h)3.583.872.481.410.22ER1.001.921.522.402.77注:与Control相比,*P0.05;与CIN、EUG相比,*P0.05。1798 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中药制剂研究(CER-NP)及促透剂(CIN、EUG、CIN-C18、EUG-C18)结构,在COMPASSII力场下,首先在Forcite模块下对结构进行优化,其次在Blend模块下进行化合物的混合,寻找最优构
13、象,最后在Dreding力场下计算各化合物间结合的键能及键长。2.6ATR-FTIR剔除兔背部毛发,标记15个的不同区域(面积为1.0 cm2),随机分 5 组(A:无水乙醇,B:1%CIN,C:3%EUG,D:CIN-C18,E:EUG-C18),并向区域内涂抹20 L含(不含)促透剂的无水乙醇溶液,渗透30 min后以空气栓塞法处死大耳兔,剥离背部皮肤(标记区域),室温下干燥15 min,利用ATR-FTIR光谱仪进行检测,其中内反射晶体为硒化锌(ZnSe),入射角为45,角质层朝下置于检测器上,在1000-4000 cm-1的检测波长范围内扫描20次,使用Origin 7.0软件对红外吸
14、收峰进行分析。2.7组织学评价剔除兔背部毛发,标记5个面积为1.0 cm2的区域,涂抹20 L含(不含)促透剂的无水乙醇溶液,5个区域分 别 为(A:无 水 乙 醇,B:1%CIN,C:3%EUG,D:1%CIN-C18,E:3%EUG-C18)。渗透1 h后,采用空气栓塞法处死大耳白兔,剥离给药区域背部皮肤,4%多聚甲醛溶液固定后将其包埋在石蜡块中,冠状切片,后用苏木精-伊红染料进行染色。组织切片均在Olympus显微镜下,10倍镜观察14。2.8统计学方法实验数据采用平均值标准差(x s)表示。使用方差分析(ANOVA)进行显著性检验,显著性水平设为P0.05。采用统计分析系统 SPSS
15、21.0 对实验结果进行统计分析处理,并使用t检验对相关系数的显著性(P0.05)进行检验。3 实验结果 3.1最佳促透浓度的筛选按“2.3.2”项下的方法分别制备含 1%、3%和 5%挥发油的FP透皮贴剂,按“2.3.3”项下的方法进行体外经皮渗透实验。以经皮累积透过量(Q24h)为纵坐标、T为横坐标绘制经皮累积渗透曲线,结果见图2。由图可知,含有不同浓度的挥发油对FP的促透效果均显著高于空白组(P0.05),故选择较小浓度1%进行后续实验。当EUG浓度为3%时,促透效果最佳。在随后的实验中,挥发油酯的浓度与挥发油类化合物等摩尔浓度。3.2最佳促透剂的筛选按“2.3.2”项下的方法制备含挥发
16、油酯的贴剂,考察挥发油及其酯对 FP经皮渗透参数的影响,结果见表1。从结果上看,与空白组相比,CIN、EUG显著增强FP 的经皮透过量,其中对 FP 的增渗比分别为 1.92,1.52。体外经皮促透实验表明,促透剂组均能够显著提高FP的经皮渗透(P0.05),EUG-C18对FP产生的促透量最大,Q24h达到(295.0345.08)gcm-2,CIN-C18仅次于EUG-C18(P0.05)。结果发现,CIN的促透效果优于EUG,而EUG-C18的促透效果优于CIN-C18。3.3体外释放实验如图3所示,为含或不含促透剂的FP贴剂的24 h内体外释放百分比,所选用促透剂分别为 1%CIN、3
17、%EUG、1%CIN-C18、3%EUG-C18,所有加入促透剂均显著增强了FP的释放(P CIN-C18CINEUG。3.4分子模拟如图 4 所示,分别为使用 Materials Studio 软件计算得到的FP-CER-NP及FP-促透剂-CER-NP的最小能量复合物。所有系统计算的氢键键能如表2所示,结果表明促透剂组计算的氢键键能绝对值均显著高于FP与CER-NP。048121620240102030405060Time(h)Cumulative release(%)NoneCIN-C18CINEUGEUG-C18图3含有挥发油及其硬脂酸酯的FP贴剂的累积释放度(x s,n=4)1799
18、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第五期 Vol.25 No.5 3.5ATR-FTIR通过ATR-FTIR检测特征峰位移情况,判断角质层“三明治”结构中烃链的有序度15。乙醇不会改变皮肤脂质烃链的排列方式及空间构象,且挥发快,短时间内可以恢复角质层屏障功能16。皮肤角质层的主要成分是脂质、角蛋白和水,在ATR-FTIR中,脂质的特征吸收峰为 vsCH2=2848.69cm-1及 vasCH2=2918.12cm-1,
19、反映脂质侧链自由度水平的指标可用CH2伸缩振动峰位移表示,波数位移的大小与CH2的偏转/全反构象体的比例有关17。角蛋白的特征吸收峰分为酰胺带(1639.39cm-1)及酰胺带(1544.89cm-1),代表蛋白质的二级结构-螺旋及-折叠18,除此之外,角质层中OH的振动吸收峰为3278 cm-1。由图5可见,与对照组相比,实验组中皮肤角质层中脂质的CH2对称及不对称振动均向高波数发生移动,其中,EUG-C18位移变化最大,除CH2振动吸收峰发生改变外,酰胺带的位移值也发生改变,均发生了蓝移现象,同时,角质层中OH的振动吸收峰也均向高波数发生移动。3.6组织学评价如图6所示为在10倍放大倍数下
20、,含或不含促透剂的兔皮肤组织切片图像,图6a为对照组下的皮肤细胞形态,可清晰观察到角质层(角质层紧密排列在活表2分子模拟计算各组氢键键能组别FP-NPFP-CIN-NPFP-EUG-NPFP-CIN-C18-NPFP-EUG-C18-NP氢键键能(kcalmol-1)-1.191-1.826-1.701-2.328-2.5324000350030002500200015001000Reflction(%)Wave number(cm-1)3286.273280.483280.483288.193278.552921.772917.922919.842919.842917.922854.2728
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