多囊卵巢综合征关键基因的筛选及其与疾病进展和预后的相关性分析.pdf
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1、论 著文章编号(23)6-0609-08基金项目 天津市卫生健康委员会科技项目(Z C 2 0 1 1 7);天津市医学重点学科(专科)建设项目(妇产科学T J Y X Z D X K-0 4 3 A);天津市科技计划项目(2 1 J C Q N J C 0 1 8 6 0);天津市北辰区科技计划项目(S H G Y-2 0 2 2 0 1 5)作者简介 孙奎奎(1 9 8 2-),女,主治医师,硕士在读,研究方向:女性不孕及围绝经期疾病的相关研究;通信作者:鞠明艳,E-m a il:ju m in g y a n o u tlo o k.c o m,任晨春,E-m a il:rc c x q
2、 y 1 6 3.c o m。多囊卵巢综合征关键基因的筛选及其与疾病进展和预后的相关性分析孙奎奎1,杨微微2,王文靖2,郝颖新2,郭波2,任晨春2,鞠明艳2(1.天津医科大学研究生院,天津300070;2.天津市中心妇产科医院检验科,天津300100)摘要 目的:通过生物信息学方法筛选多囊卵巢综合征(PCOS)的关键基因并分析其与PCOS进展和预后的相关性。方法:在GEO数据库中下载GSE34526数据集的表达谱,利用R软件筛选数据集中PCOS患者卵巢颗粒细胞(n=7)和正常颗粒细胞(n=3)的差异表达基因(DEGs),对DEGs进行基因本体论(GO)和京都百科全书基因和基因组(KEGG)富集
3、分析,识别关键基因。使用单样本基因富集分析(ssGSEA)评分量化每个PCOS样本中的免疫信号的富集水平,进行抗肿瘤免疫和促肿瘤抑制评分。利用人类蛋白质图谱数据库(HPA)分析关键基因在卵巢癌(OC)、乳腺癌(BRCA)和子宫内膜癌(UCEC)中的蛋白表达水平,绘制ROC曲线分析3年、5年和10年癌症生存率。结果:本研究共筛选出16个DEGs,GO和KEGG分析结果显示DEGs在PCOS患者的细胞黏附分子(CAMs)、补体和凝血级联、上皮细胞迁移和炎症反应的正向调控等通路中富集,进一步筛选出2个关键基因,ITGAM和HMOX1。二者与促炎免疫细胞(如巨噬细胞、MDSCs、中性粒细胞、浆细胞样树
4、突状细胞、调节性T细胞)的相关性分析显示,ITGAM(P分别为0.001、0.001、0.051、0.04、0.001)和HMOX1(P分别为 0.001、0.001、0.001、0.5,其中10年AUC 0.59。HMOX1在BRCA、OC和UCEC中的3年AUC 0.5,在BRCA中的10年AUC 0.6,均有较好的预测效能。ITGAM+HMOX1联合预测在BRCA中的3、5、10年AUC分别为0.51、0.498、0.606,在OC中分别为0.563、0.537、0.481,在UCEC中分别为0.556、0.479、0.472。结论:ITGAM和HMOX1可以作为PCOS的潜在诊断和治疗
5、靶点,其表达水平可以评价PCOS病情发展及预后。关键词多囊卵巢综合征;生物信息学分析;ITGAM;HMOX1中图分类号R711文献标志码Screening of key genes in polycystic ovary syndrome and analysis of their correlation with diseaseprogression and prognosisSUN Kui-kui1,YANG Wei-wei2,WANG Wen-jing2,HAO Ying-xin2,GUO Bo2,REN Chen-chun2,JU Ming-yan2(1.School of Gradu
6、te,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Department of Clinical Laboratory,Tianjin Central Hospitalof Obstetrics and Gynecology,Tianjin 300100,China)AbstractObjective:Toscreenkeygenesofpolycysticovarysyndrome(PCOS)usingbioinformaticanalysis,andtoexploretheirpredictiveeffects on the progr
7、ession and prognosis of PCOS.Methods:The expression profile of the GSE34526 dataset was downloaded from the GEOdatabase,and the differential expression genes(DEGs)of ovarian granulosa cells(n=7)and normal granulosa cells(n=3)of PCOS patientsin the dataset were screened using R software.Genetic Ontol
8、ogical(GO)and Kyoto Encyclopedia Gene and Genome(KEGG)enrichmentanalyses were performed on DEGs to identify key genes.A single-sample geneset enrichment analysis(ssGSEA)score was used to quantifythe level of immune signal enrichment in each PCOS sample to perform anti-tumor immunity and pro-tumor in
9、hibition scores.The HumanProtein Profile Database(HPA)was used to analyze the protein expression levels of key genes in ovarian cancer(OC),breast cancer(BRCA)and uterine corpus endometrial cancer(UCEC).ROC curves were plotted to analyze the 3-year,5-year and 10-year cancersurvival rates.Results:In t
10、his study,a total of 16 DEGs were screened.The results of GO and KEGG analysis showed that DEGs wasenriched in the pathways of cell adhesion molecules(CAMs),complement and coagulation cascade,epithelial cell migration and positiveregulation of inflammatory response in PCOS patients.Two key genes,ITG
11、AM and HMOX1,were further screened.Correlation analysis between the two genes and pro-inflammatory immune cells(such as macrophages,MDSCs,neutrophils,plasmacytoid dendritic cells,regula天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University第29卷6期23年11月 29熏 6Nov.23609toryTcells)showedthatITGAM(Pvalues0.001,0.0
12、01,0.051,0.04,0.001,respectively)and HMOX1(P values 0.001,0.001,0.001,0.001,0.5,andtheAUCat10-yearwas0.59.The3-yearAUC of HMOX1 in BRCA,OC and UCEC were 0.5,and the 10-year AUC in BRCA were 0.6,which showed good predictive efficiency.The combined ITGAM+HMOX1 forecast for the 3-year,5-year and 10-yea
13、r AUC in BRCA were 0.51,0.498 and 0.606,respectively.InOC,the values were 0.563,0.537 and 0.481,respectively.In UCEC,they were 0.556,0.479 and 0.472,respectively.Conclusion:ITGAMand HMOX1 can be used as potential diagnostic and therapeutic targets for PCOS,and their expression levels can be used to
14、evaluate thedevelopment and prognosis of PCOS.Key wordspolycystic ovary syndrome;bioinformatic analysis;ITGAM;HMOX1多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是育龄妇女最常见的妇科内分泌疾病之一,临床表现多为排卵障碍/无排卵、多囊卵巢、高雄激素血症1,临床发病率可达4%21%2。PCOS不仅影响生殖内分泌功能,还可能增加代谢综合征、糖尿病、心血管疾病等并发症的长期风险,严重威胁女性健康3。此外,伴随严重的月经减少、闭经而发生的雌激素水平的破坏
15、也会增加子宫内膜增生和子宫内膜癌(UCEC)的发生风险4。PCOS是由遗传、内分泌、环境等多种因素引起的5,然而,PCOS的发病和进展机制尚不清楚6。因此,临床医生必须及时掌握预测、诊断和评估PCOS患者康复状态的方法,以控制病情进展,改善预后。近几年,生物信息学分析和公共数据库的蓬勃发展7,为发现PCOS潜在的分子靶点和制定新的诊断治疗策略提供了基础。在本研究中,笔者使用生物信息学工具分析了基因表达综合(gene expression omnibus,GEO)数据库(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中的数据集,以确定PCOS患者和匹配对照组之间的差异表达基因,
16、为进一步的临床应用和实验研究提供客观依据。1对象与方法1.1研究对象从GEO数据库7中检索和下载GSE34526数据,从TCGA数据库中下载卵巢癌(ovarian cancer,OC)、乳腺癌(breast cancer,BRCA)、子宫内膜癌UCEC的临床和表达数据8,分析差异基因对女性肿瘤的影响。1.2研究方法1.2.1差异基因分析使用R/Bioconductor的软件及Limma包分析基因表达数据9。对GSE34526数据集中的7例PCOS患者和3例对照样本的基因表达进行limma归一化,分析差异表达基因,校正后P1被认为差异有统计学意义。使用ggplot2包绘制火山图,pheatmap
17、包绘制热图。1.2.2KEGG和GO富集分析使用R软件中的clusterProfiler 4.4.4包10对差异基因进行京都基因与基因组百科全书(KEGG,http:/www.kegg.jp/)和基因本体论(GO,富集分析http:/www.geneontology.org)11-12,校正P0.05为差异有统计学意义。并将结果可视化,利用ggplot2包绘制KEGG气泡图和GO条形图。1.2.3单样本基因富集分析(single-sample gene setenrichment analysis,ssGSEA)为 了 进 一 步 研 究PCOS的炎症微环境,从表达数据推断免疫细胞浸润的相对水
18、平,本研究整合了免疫相关变量的方法进行计算。使用这种方法,将PCOS表达数据转换为标准化分数,以表示特定免疫细胞类型的相对丰度。为了在免疫图谱上可视化免疫表型,将来自PCOS患者和对照组的10个样本分类为免疫“热”和“冷”位点,根据其评分进行比较。使用ssGSEA评分13量化每个PCOS样品中29个免疫信号的富集水平,收集免疫细胞基因集,进行抗肿瘤免疫和促肿瘤抑制评分14。免疫评分通过R包gsva的“ssgsea”方法进行富集,热图和线性图由pheatmap和ggplot2包绘制。1.2.4人类蛋白质图谱利用人类蛋白质图谱数据库在(The Human Protein Atlas,HPA)(ht
19、tps:/www.proteinatlas.org/)收集肿瘤组织和正常组织的蛋白表达谱15,分析差异基因在BRCA、OC和UCEC中的蛋白表达水平。1.2.5生存分析采用Kaplan-Meier图分析差异基因在BRCA、OC及UCEC预后中的表达,利用survival和survivalROC软件包,基于受试者工作特征(ROC)曲线分析3年、5年和10年癌症生存率。2结果2.1与PCOS患者相关的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)的鉴定结合TCGA第29卷天津医科大学学报610女性癌症临床数据和GEO数据库RNA阵列数据的分析,筛选PCOS潜
20、在标志物(图1A)。最终共筛选出16个校正P值有显著差异的基因,分别为CD163、MRC1、MAFB、EPB41L3、ITGAM、FCGR1B、TGFBI、EMB、HMOX1、CD93、LILRB3、VSIG4、HLA-DPA1、SIGLEC10、HAS2、MMP9(图1B)。其中,HAS2在对照组中表达,而在PCOS患者中不表达;与PCOS进展高度相关的基因MMP9在PCOS组中高表达;在PCOS组中,巨噬细胞标志物MRC1高表达(图1C)。差异表达基因的相关性分析表明,ITGAM和HMOX1与其他基因具有强相关性(P0.05,图1D)。2.2ITGAM和HMOX1是与PCOS患者疾病进展相
21、关的关键基因对上述16个DEGs分别进行GO和KEGG富集分析。KEGG通路富集结果显示细胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)、补体和凝血级联与PCOS的进展相关(图2A)。GO富集结果显示为生物学进程中上皮细胞迁移和创面炎症反应的正向调控(图2B),尤其是MHC 类受体活性和免疫受体活性在GO功能分析中富集。这些失调的信号通路可能导致PCOS患者卵巢功能受损。最终在这些通路中富集得到ITGAM和HMOX1两基因,二者在本研究中被定义为与PCOS进展高度相关的基因。2.3ITGAM、HMOX1与PCOS患者免疫浸润异质性的相关性在PCOS患者中,免疫抑制细胞类
22、型如骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)、中性粒细胞、巨噬细胞、浆细胞样树突状细胞和调节性T细胞评分较高(图3A)。免注:A:工作流程图;B:数据集GES34526火山图,红色代表上调基因,蓝色代表下调基因,校正P1表示差异有统计学意义;C:10个样本中的DEGs表达热图,对数据进行Z-score标准化,红色表示高表达,蓝色表示低表达;D:DEGs之间的相关性热图,红色到白色表示强相关性(P0.05);PCOS:多囊卵巢综合征;DECs:差异表达基因图1PCOS患者与对照组DEGs的鉴定Fig 1Identification of
23、 DEGs in PCOS patients and control groupABCD6420DownNot sigUpCOF-6-3036log2(fold change)-log10(p-value)孙奎奎,等.多囊卵巢综合征关键基因的筛选及其与疾病进展和预后的相关性分析第6期611注:A:KEGG富集分析气泡图;B:GO富集条形图,校正P0.05表示差异有统计学意义图2DEGs的功能和通路富集情况Fig 2Functional and pathway enrichment of DEGs疫细胞分为促肿瘤抑制和抗肿瘤免疫,PCOS组的样本更接近于促肿瘤抑制(图3B)。ITGAM和HMOX
24、1基因的表达相关性分析显示,ITGAM与HMOX1表达呈正相关(r=0.69,P=0.028,图3C)。ITGAM、HMOX1与促炎免疫细胞的相关性分析显示,ITGAM与巨噬细胞(r=0.86,P=0.001)、MD注:A:利用ssGSEA鉴定GSE34526数据集中10个样本免疫细胞群的相对浸润;B:发挥抗肿瘤免疫功能的细胞类型与发挥促肿瘤免疫抑制功能的细胞类型的浸润之间的相关性,执行抗肿瘤免疫的细胞类型(ActCD4、ActCD8、TcmCD4、TcmCD8、TemCD4、TemCD8、Th1、Th17、ActDC、CD56briNK、NK、NKT)与执行促肿瘤免疫抑制功能的细胞类型(Tr
25、eg、Th2、CD56dimNK、imDC、TAM、MDSCs、Neutropl、pDC)与浸润之间的相关性分析,线性关系使用Pearson相关系数r表示,阴影区域代表95%置信区间;C:ITGAM(X轴)和HMOX1(Y轴)的相关性分析图3ITGAM、HMOX1与PCOS免疫细胞的相关性分析Fig 3Correlation analysis of ITGAM,HMOX1 and immune cells in PCOSABABC1050-10-5-15Pro-tumor suppression-20-100104 0002 000HMOXI25005000750010000ITGAM0第29
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- 卵巢 综合征 关键 基因 筛选 及其 疾病 进展 预后 相关性 分析