儿童变应性鼻炎Th17_Treg表达与中医证型及病情的相关性研究.pdf
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1、 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医诊疗研究儿童变应性鼻炎Th17/Treg表达与中医证型及病情的相关性研究谢柳,李淑芳,王翔,符国庆,王海川(海南省中医院 海口 570203)摘要:目的探讨不同中医证型变应性鼻炎(AR)患儿Th17/Treg及其细胞因子的表达特点,并分析Th17/Treg细胞失衡与儿童AR症状评分的相关性。方法130例AR患儿根据中医证型分为肺气虚寒组(50例)、脾气虚弱组(32例)、肾阳不足
2、组(21例)和肺经伏热组(27例),30例健康儿童为对照组。检测各组外周血Th17、Treg细胞水平和IL-17、TNF-、IL-10、TGF-表达水平。并分析不同中医证型患儿Th17/Treg比值与AR症状评分的相关性。结果Th17细胞水平和IL-17、TNF-水平在肺经伏热证患儿中表达最高,肺气虚寒证和脾气虚弱证次之,肾阳不足证最低。肺气虚寒证和脾气虚弱证Treg细胞水平和IL-10、TGF-水平低于肺经伏热证和肾阳不足证。肺气虚寒证和脾气虚弱证患儿Th17/Treg比值最高,肺经伏热证次之,肾阳不足证最低。各中医证型患儿Th17/Treg比值均与AR症状评分呈正相关(P0.05)。本研究
3、 收稿日期:2022-06-19 修回日期:2022-10-15 海南省卫生计生委普通科研课题(19A200038):梅花针拔罐法结合玉屏风颗粒治疗变应性鼻炎的临床研究;负责人:李淑芳。通讯作者:谢柳,主治医师,主要研究方向:中医药治疗变应性鼻炎的基础与临床研究。1481 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 得到海南省中医院伦理委员会批准,所有入选儿童及其家长均对本研究知情同意。1.2诊断标
4、准1.2.1西医诊断标准根据 儿童变应性鼻炎诊断和治疗指南(2010年,重庆)5制定儿童变应性鼻炎诊断标准:出现鼻痒、喷嚏、鼻塞、清水样涕等症状中的2项或2项以上,持续或累积时间每天1 h,可伴有眼痒、流泪、结膜充血等眼部症状;鼻腔见水样分泌物,鼻黏膜灰白、苍白或浅蓝色,鼻甲肿大;至少一种变应原点刺试验阳性和/或血清特异性IgE阳性。1.2.2中医辨证标准参照 鼻鼽中医诊疗指南4和 中医儿科临床诊疗指南 小儿鼻鼽6制定儿童AR辨证分型标准:肺气虚寒证,主症:鼻塞、鼻痒、喷嚏、流清涕、鼻黏膜淡红或苍白、鼻甲肿大;次症:畏风怕冷、气短懒言、语声低怯、自汗、或见咳嗽痰稀、面色白、舌淡红、苔薄白、脉浮
5、或细弱。脾气虚弱证,主症:喷嚏、鼻塞、鼻痒、流清涕、鼻黏膜淡白、鼻甲肿胀;次症:食少、便溏、腹胀、倦怠乏力、头身困重、面色萎黄、舌淡胖、边有齿痕、苔白、脉滑或细弱。肾阳不足证,主症:鼻痒、喷嚏、鼻塞、流清涕、鼻黏膜苍白、鼻道水样分泌物;次症:畏寒肢冷、腰膝酸软、面色无华、神疲倦怠、小便清长、舌淡、苔白、脉沉细。肺经伏热证,主症:鼻痒、鼻塞、喷嚏频发、流清涕或粘稠涕、鼻黏膜偏红、鼻甲肿胀;次症:口干烦热、咽痒可伴有咳嗽、鼻腔干燥、面色红赤、小便短赤、舌红、苔黄、脉数。以上4种证型辨证要求均为具备3项主症加3项以上次症。1.3研究组纳入及排除标准纳入标准:符合上述西医诊断标准,且中医辨证明确;年龄
6、6-12岁;自愿参与本研究,并签署知情同意书。排除标准:确诊为急性鼻窦炎、血管运动性鼻炎、嗜酸性粒细胞增多症者;合并哮喘、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、肾小球肾炎、过敏性紫癜等自身免疫、变应性疾病者;既往3个月内接受过糖皮质激素或免疫抑制剂治疗者;合并肝、肾功能不全、免疫缺陷或精神障碍者。1.4对照组纳入标准年龄6-12岁;血常规、肝肾功等检查结果在正常范围;1 个月内无急性感染;既往无 AR、哮喘、类风湿关节炎、强直性脊柱炎、肾小球肾炎、过敏性紫癜等自身免疫、变应性疾病;自愿参与本研究,并签署知情同意书。1.5检测指标1.5.1外周血Th17细胞检测入选研究对象均于晨起空腹采集静脉血,采用人淋
7、巴细胞分离液分离外周血单一核细胞(PBMCs),应用 RPMI1640 培养基调整 PBMCs 浓度为 1107mL-1,取PBMCs悬液100 L接种于培养液,加入PMA、离子霉素和莫能菌素,37、5%CO2细胞培养箱培养6 h,将培养出的细胞等分为两份,分别标记为测定管和对照管,每管均加入20 L PE-CD4抗体,室温下避光孵育20 min,洗涤后加固定液,室温避光反应20 min后加入破膜剂进行细胞打孔,1500 rmin-1离心5 min,弃上清后于测定管加 10 L IL-17-PE,对照管加 10 L IgG1-PE,室温避光孵育15 min进行细胞因子染色,应用流式细胞仪检测T
8、h17细胞占CD4+T细胞的比例。1.5.2外周血Treg细胞检测另取 PBMCs 悬液 100 L,加入 FITC-CD4 单抗20 L和PE-CD25单抗5 L,室温避光孵育20 min,缓冲液洗涤细胞,离心弃上清,涡旋分散细胞后加入1 mL固定/破膜工作液,室温避光孵育30 min,洗涤细胞并离心弃上清,加 100 L permeabilization buffer 重悬细胞后加入 200 L 二抗 Foxp3,室温避光孵育20 min,再次洗涤细胞并弃上清,用适量流式染色液重悬细胞后应用流式细胞仪检测Treg细胞占CD4+T细胞的比例。1.5.3Th17、Treg细胞因子检测所有研究对
9、象均于晨起空腹采集静脉血 5 mL,3000 rmin-1离心10 min,收集血清样本,应用全自动化学发光分析仪及配套试剂盒,采用酶联免疫吸附法检测Th17、Treg细胞的主要细胞因子白细胞介素-17(IL-17)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、白细胞介素-10(IL-10)和转化生长因子-(TGF-)水平。1.5.4AR患儿病情严重程度评估应用AR症状评分对AR患儿的病情严重程度进行评估,参照 变应性鼻炎诊断和治疗指南(2015年,天津)7对AR患儿入组时喷嚏、流涕、鼻塞、鼻痒4个症状进行评分,评分标准见表1,总分0-12分,症状评分越高代表患儿病情越严重。1.6统计学方法采用SPSS 22
10、.0进行数据统计分析,计数资料以百1482 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医诊疗研究分比表示,组间比较采用2检验,计量资料以均值标准差(x s)表示,多组间比较采用单因素方差分析,各组间两两比较采用 LSD 多重比较,Th17/Treg 比值与AR症状评分相关性采用Pearson相关分析,以P0.05),见表2。表2儿童AR患者中医证型分布情况比较x s,例(%)组别肺气虚寒证脾气虚弱证肾阳不足证肺经伏热证F或
11、2值P值n50322127年龄(岁)9.101.699.061.779.411.669.031.730.4590.711性别(男)29(58.00%)14(43.75%)13(61.90%)18(66.67%)3.5460.315病程(年)1.400.471.350.351.250.511.200.531.1080.348表3同中医证型患儿Th17、Treg细胞水平及Th17/Treg比值比较(x s)组别肺气虚寒组脾气虚弱组肾阳不足组肺经伏热组对照组F值P值n5032212730Th17(%)2.811.01*2.640.87*1.930.56*3.551.13*1.450.2225.295
12、0.000Treg(%)2.540.85*2.480.83*3.521.06*3.871.25*4.640.6733.4190.000Th17/Treg1.270.32*1.230.31*0.640.29*1.050.28*0.320.6673.9700.000注:与对照组比较,*P0.05;与肺经伏热组比较,P0.05;与肾阳不足组比较,P0.05。表1鼻部症状分级评分标准记分0分1分2分3分喷嚏(连续个数)33-56-10 10流涕(次/天)几乎无 45-9 10鼻塞几乎无有意吸气时可感觉间断出现近乎全天用口呼吸鼻痒几乎无间断出现蚁行感,可忍受蚁行感,难以忍受表4同中医证型患儿血清Th17
13、、Treg细胞因子比较(x s,pgmL-1)组别肺气虚寒组脾气虚弱组肾阳不足组肺经伏热组对照组F值P值n5032212730IL-1744.6711.18*45.0610.12*37.999.82*54.1612.52*29.109.0921.7440.000TNF-13.253.02*13.903.20*11.632.48*16.284.34*9.742.2817.1470.000IL-1056.569.53*61.148.85*67.8811.95*73.2115.56*82.5216.8223.6890.000TGF-20.799.54*18.326.73*27.318.69*27.9
14、411.27*35.6512.0315.7890.000注:与对照组比较,*P0.05;与肺经伏热组比较,P0.05;与肾阳不足组比较,P0.05。1483 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology 2023 第二十五卷 第四期 Vol.25 No.4 2.2不同中医证型患儿Th17、Treg细胞水平和Th17/Treg比值比较各证型患儿Th17细胞水平和Th17/Treg比值均高于对照组,Treg细胞水平均低于对照组(P0.05),表明不同中医证型
15、 AR 患儿均存在不同程度的 Th17/Treg细胞免疫失衡。各证型间比较,肺经伏热组Th17细胞水平高于其他 3 种证型,肺气虚寒组和脾气虚弱组Th17细胞水平高于肾阳不足组(P0.05),表明肺经伏热证AR患儿机体免疫炎症反应最严重。肺气虚寒组和脾气虚弱组Treg细胞水平低于肺经伏热组和肾阳不足组(P0.05),表明肺气虚寒证和脾气虚弱证患儿的免疫抑制功能较差。肺气虚寒组和脾气虚弱组Th17/Treg比值高于肺经伏热组和肾阳不足组,肺经伏热组Th17/Treg比值高于肾阳不足组(P0.05),表明肺气虚寒和脾气虚弱证 AR患儿的 Th17/Treg细胞免疫失衡最严重,见表32.3不同中医证
16、型患儿血清Th17、Treg细胞因子比较各证型患儿血清IL-17、TNF-水平均高于对照组,血清 IL-10、TGF-水平均低于对照组(P0.05),表明不同中医证型AR患儿均存在不同程度的免疫失衡。各证型间比较,肺经伏热组血清IL-17、TNF-水平高于其他3种证型,肺气虚寒组和脾气虚弱组血清IL-17、TNF-水平高于肾阳不足组(P0.05),表明肺经伏热证AR患儿机体免疫炎症反应最严重。肺气虚寒组和脾气虚弱组血清IL-10、TGF-水平低于肺经伏热组和肾阳不足组(P0.05),表明肺气虚寒证和脾气虚弱证AR患儿的免疫抑制功能较肺经伏热证和肾阳不足证患儿差,见表4。2.4不同中医证型AR患
17、儿Th17/Treg比值与病情的相关性分析经 Pearson 相关分析显示,肺气虚寒证(r=0.474,P=0.001)、脾气虚弱证(r=0.444,P=0.011)、肾阳不足Th17/Treg比值1.251.000.750.500.25症状评分(分)9.08.07.06.05.04.0r=0.661 P=0.001图3肾阳不足证患儿AR症状评分与Th17/Treg比值的相关性Th17/Treg比值1.601.401.201.000.800.60症状评分(分)11.010.09.08.07.06.05.0r=0.529 P=0.001图4肺经伏热证患儿AR症状评分与Th17/Treg比值的相关
18、性Th17/Treg比值2.001.751.501.251.000.75症状评分(分)11.010.09.08.07.06.0r=0.474 P=0.001图1肺气虚寒证患儿AR症状评分与Th17/Treg比值的相关性Th7/Treg比值1.751.501.251.000.75症状评分(分)12.011.010.09.08.07.06.0r=0.444 P=0.011图2脾气虚弱证患儿AR症状评分与Th17/Treg比值的相关性1484 Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science
19、and Technology 世界科学技术-中医药现代化中医诊疗研究证(r=0.661,P=0.001)、肺经伏热证(r=0.529,P=0.001)4 个中医证型 AR 患儿的症状评分均随外周血 Th17/Treg比值的升高而增高,Th17/Treg比值与AR症状评分呈正相关,见图1-4。3 讨论 传统中医认为鼻鼽的病机为脏腑功能虚弱基础上感受风寒而所致,是正虚与邪侵共同作用的结果,正虚集中表现为肺、脾、肾三脏气阳虚弱。虚寒之体感受外邪,则邪易从寒化,留滞鼻腔而为病8-9。因此目前将变应性鼻炎归纳为肺气虚寒证、脾气虚弱证、肾阳不足证、肺经伏热证4个基本证型。本研究显示儿童AR中以肺气虚寒证为
20、主,肾阳不足证所占比例最低。由于传统中医辨证易受医师主观因素和临床经验的限制,且AR发生于深在腔窍器官,如不借助现代医学检测技术,很难对局部表现有准确认知。因此现代中医倡导将中医辨证与现代技术手段相结合,以提高中医辨证的准确率和客观性,而Th17/Treg细胞失衡与多种免疫性疾病中医证型间的相关性研究是近年来的研究热点。AR发病的免疫机制极其复杂,涉及多种细胞因子、炎症细胞及信号传导通路,其中 Th17/Treg 免疫失衡便是AR发生、发展的重要机制之一。Th17细胞是 一 种 新 型 CD4+T 细 胞 亚 群,主 要 分 泌 IL-17 和TNF-,具有强大的促炎作用,可以聚集、活化嗜酸性
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