鹅膏毒肽中毒动物模型建立的研究进展.pdf
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1、 年 月第 卷 第 期中国实验动物学报 张慧洁,杨根梦,王浩伟,等 鹅膏毒肽中毒动物模型建立的研究进展 中国实验动物学报,():,():基金项目云南省科技厅基础研究项目(,),司法部司法鉴定重点实验室开放课题()。(,),()作者简介张慧洁(),男,硕士,研究方向:野生菌中毒及毒理机制。:;杨根梦(),女,博士,讲师,研究方向:野生菌中毒及毒理机制。:。共同第一作者通信作者曾晓锋(),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:野生菌中毒及毒理机制。:;李桢(),女,学士,教授,硕士生导师,研究方向:野生菌中毒及毒理机制。:。共同通信作者鹅膏毒肽中毒动物模型建立的研究进展张慧洁,杨根梦,王浩伟,曾晓
2、锋,李桢(国家卫健委毒品依赖和戒治重点实验室 昆明医科大学法医学院法医系,昆明)【摘要】蘑菇中毒是我国最严重的食品安全问题之一。以上蘑菇中毒致人死亡事件是因误食含鹅膏毒肽的蘑菇。目前,关于鹅膏毒肽毒理机制、毒代动力及中毒治疗研究众多,但缺乏不同目的动物模型建立的综述。因此,本文根据实验目的及内容对动物选用、毒药物类型、注射方式及剂量等多方面进行综述,旨在为建立鹅膏毒肽中毒动物模型提供理论依据和参考。【关键词】鹅膏毒肽;中毒;动物模型;毒代动力;中毒治疗【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】(),(,):;:【】,【】;:我国毒蘑菇种类丰富,国内中毒事件频发,中国疾病预防控制中心发布的数据显示
3、,在 年期间共报告 起蘑菇中毒事件,导致 人死亡。云南、湖南、四川等地发生率最高,多集中在 月。灰花纹鹅膏、致命鹅膏、鳞柄白鹅膏及淡红鹅膏等蘑菇为剧毒。目前,分离出的毒素主要为鹅膏毒肽、鬼笔毒肽及毒伞肽 类,而鹅膏毒肽则是致人死亡的最主要有毒物质。中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ,鹅膏毒肽鹅膏菌()属于担子菌门中的一种真菌,多由菌盖、菌褶、菌柄、菌环及菌托 部分组成,但存在形态差异。有毒鹅膏菌各部位所含鹅膏毒肽含量有所差别,菌盖及菌褶处含量相对较高。不同发育时期的鹅膏菌所含鹅膏毒肽含量也有不同,早期发育阶段含量相对较高。鹅膏毒肽不仅存在于鹅膏菌属部分蘑菇内,也存在于盔孢菌属、环柄菇属及丝
4、盖伞属等部分的蘑菇中。根据侧链取代基不同,鹅膏毒肽可以分为 鹅膏毒肽、鹅膏毒肽、鹅膏毒肽、鹅膏毒肽、鹅膏酸、鹅膏酰胺、鹅膏蕈、鹅膏蕈酸和普罗马琳等。目前,研究多集中在 鹅膏毒肽、鹅膏毒肽上。鹅膏毒肽为双环八肽,分子量约为 ,其化学性质稳定,耐高温、耐酸碱等的特点使得在加热烹饪后仍具毒性,仅 剂量可致人死亡。新鲜蘑菇组织中鹅膏毒肽含量较高时,食用少于 足以导致中毒死亡。鹅膏毒肽是一类迟发性毒素,中毒后早期无明显症状,待出现症状后已经造成人体损伤,部分患者经治疗后症状会有所缓解,往往会被误以为处于恢复期,然而随着中毒时间的延长,患者则会出现肝功能衰竭,更甚者出现多器官衰竭。由于鹅膏毒肽特殊毒理特性
5、,可以特异性抑制 聚合酶,其被用于生物转录相关研究中。此外,鹅膏毒肽在抗肿瘤、抗病毒领域也发挥重要作用。鹅膏毒肽中毒的评估临床上,经过潜伏期后,患者会出现恶心、呕吐、腹痛等胃肠炎症状,严重者可出现脱水,甚至休克。随着中毒时间的延长,经实验室检查可以发现,血 清 中 丙 氨 酸 氨 基 转 移 酶(,)、天门冬氨酸氨基转 移 酶(,)、胆红素等会升高。中毒晚期,患者可能出现多器官衰竭,甚至死亡,。其他动物的生理结构与人类存在一定差异。因此,在建立动物模型时,需结合动物本身的特点,对动物进行中毒评估。一般观察指标建立鹅膏毒肽动物模型后,密切观察实验动物的存活情况。由于鹅膏毒肽毒性特点,研究发现,鹅
6、膏毒肽中毒后,实验动物中毒早期可能会出现警惕性下降、嗜睡、活动减少、摄食减少、体重下降等改变;中毒加深后可能会出现呼吸困难、抽搐,甚至死亡。根据实验需要可建立实验动物观察标准,如观察实验动物运动姿势、整理毛发等外观改变;体重、心率、呼吸、精神状态等临床指标,依据观察标准进行评分。对于中毒治疗模型,可记录实验动物的脏器系数,实验动物某器官的重量与其自身体重的比值可以反应器官损害程度,也可作为药物减轻鹅膏毒肽对器官损害的指标。设备辅助观察与检测取出的动物器官进行甲醛固定、脱水、切片、染色、封片、病理学观察等,镜下较为直观地观察组织细胞的改变,如肝细胞坏死、炎性细胞浸润等改变。此外,有实验室检查结果
7、也可反应鹅膏毒肽对组织器官的损伤程度。血液进行血生化检测,检测肝功能,如、胆红素等指标。还可通过检测仪器,如液相色谱质谱联用(,),检测血液、尿液、胆汁、组织器官等中的鹅膏毒肽的浓度,反应鹅膏毒肽在体内的代谢与分布情况。建立鹅膏毒肽中毒的动物模型 建立鹅膏毒肽中毒的毒理学模型鹅膏毒肽进入机体后,肝细胞膜上相关转运受体可将其转入肝细胞内。鹅膏毒肽可特异性抑制真核细胞 聚合酶,从而导致肝细胞 转录及蛋白质合成障碍。此外,鹅膏毒肽还导致肝组织发生氧化应激,活性氧(,)产生增多,氧化 抗氧化系统失衡引起肝组织损伤。鹅膏毒肽通过线粒体途径诱导肝细胞凋亡外,还可以通过 途径介导凋亡。鹅膏毒肽可诱导肝细胞自
8、噬,但自噬与凋亡之间的相互作用关系,尚不明确。等建立鹅膏毒肽中毒模型,选用 敲除成年雄性小鼠,腹腔注射 鹅膏毒肽,后在戊巴比妥麻醉下收集血样及肝组织样本。选用与实验组年龄相匹配的雄性 和 小鼠作为野生型对照,验证 受体转运 鹅膏毒肽的功能。等选用 的雄性 小鼠,分别腹腔注射 、鹅膏毒肽,后取血安乐死小鼠。通过检测氧化应激等指标,说明氧化应激在 鹅膏毒肽诱导肝毒性中的重要作用。而 等选用 周 雄性 小鼠,采用 、中国实验动物学报 年 月第 卷第 期 ,、等比剂量给小鼠腹腔注射 鹅膏毒肽。根据其浓度对小鼠的作用,再选择、的 鹅膏毒肽腹腔注射小鼠,于、各时间点进行眶后静脉丛采血和取肝组织,用于肝功能
9、检测及对肝组织进行病理检查。进一步实验证实 鹅膏毒肽通过氧化应激相关凋亡途径造成肝损伤。等同样选用雄性 小鼠进行建模,但采用尾静脉注射方式注射 鹅膏毒肽。将小鼠随机分组成 、剂量组,静脉注射 鹅膏毒肽后观察小鼠存活,从而得出半数致死量(,)。根据再次尾静脉注射 鹅膏毒肽,并于、各时间点进行左、右眶静脉采血并取内脏器官。通过计算脏器指数反应器官的损伤程度。等根据相关研究选择 及 剂量,采用腹腔注射方式注射 鹅膏毒肽,但选用 月龄左右 小鼠建立动物模型,研究鹅膏毒肽中毒的量效关系。综上,毒理动物模型多选用小鼠建立,注射方式多选择腹腔注射,便于操作。灌胃方式可较好模拟人食用有毒蘑菇,但操作具有一定难
10、度。鹅膏毒肽的剂量选择上存在差异,因此,实验前需确定中毒量效关系,验证后选择合适的实验剂量与时间。根据实验将实验动物、注射方式、毒物类型及剂量选择汇总成下表。表 实验动物、注射方式、药物及剂量汇总 ,动物类型 注射方式 毒物类型 剂量()()参考文献 敲除小鼠 腹腔注射 鹅膏毒肽 小鼠 腹腔注射 鹅膏毒肽、小鼠 腹腔注射 鹅膏毒肽、小鼠 尾静脉注射 鹅膏毒肽 小鼠 腹腔注射 鹅膏毒肽、小鼠 腹腔注射 条盖盔孢伞提取物 、大鼠 腹腔注射 假淡红鹅膏提取物 、版纳微型实验猪 胃管灌胃 致命鹅膏提取物 新西兰纯种白兔 灌胃灰花纹鹅膏提取物 建立鹅膏毒肽中毒的毒代动力学模型鹅膏毒肽化学性质稳定,经消化
11、道消化后仍可保持活性,吸收入血,经门静脉进入肝,随之进行血液循环。鹅膏毒肽在血液中蛋白结合率极低,同时较快被清除,经尿液排出体外。超过 后不易从血液中检测,而 后仍可从尿液中检测出鹅膏毒肽,在体内不经转化以原形排出。部分鹅膏毒肽随胆汁排泄后经肠道吸收再次入血,形成肝肠循环。鹅膏毒肽不经母乳排出,也不能通过胎盘屏障,。等用大鼠建立动物模型,选用 周 大鼠,腹腔注射 鹅膏毒肽。通过眶静脉采血的方式收集、的血液至抗凝管内,离心后检测血清中 鹅膏毒肽。注射 后,血清中检测不出 鹅膏毒肽。等选择 大鼠建立动物模型时,采用静脉注射的方式注射亚急性毒性剂量 鹅膏毒肽。并于、收集血液至抗凝管。离心后检测血清中
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