芳香烃受体(AhR)活化对免疫应激仔猪肠道菌群及短链脂肪酸含量的影响.pdf
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1、NO.20202318猪营养饲料研究FEEDRESEARCH芳香烃受体(AhR)活化对免疫应激仔猪肠道菌群及短链脂肪酸含量的影响吴小妹姬孟瑶杨文方懿邓谭杰安兆翔张亚磊苟文娟*(海南大学动物科技学院,海南海口57 0 2 2 8)摘要:试验旨在探究芳香烃受体(AhR)活化对免疫应激仔猪结肠菌群及短链脂肪酸含量的影响。选择21日龄健康状态良好、体重相近的断奶仔猪2 4头,随机分为4组,每组6 个重复,每个重复1头猪。对照组(CO N)仔猪饲喂基础日粮,LPS应激组(LPS)仔猪屠宰前腹腔注射10 0 g/kgBW脂多糖(LPS)。FICZ组(FICZ)仔猪腹腔注射2 50 g/kg6-甲酰基吲哚并
2、3,2-B)咔唑(FICZ)+屠宰前注射LPS,CD N组(CDN)仔猪腹腔注射6 mg/kg豆蔻明(CDN)+屠宰前注射LPS。试验期15d。结果显示,与LPS组相比,FICZ组丙酸、丁酸和戊酸含量显著增加(P0.05);CD N组仔猪结肠Chao1、O b s e r v e d s p e c i e s 指数显著增加(P0.05),戊酸含量增加。与LPS组相比,在门水平上,FICZ和CDN组仔猪结肠蓝藻门相对丰度明显增加,厚壁菌门相对丰度明显降低;在属水平上,FICZ和CDN组仔猪结肠Anaerotruncus、梭状芽孢杆菌属、阿利斯佩斯菌属、盐单胞菌属、气微菌属、Sediminisp
3、irochaeta、帕拉普菌属、粪球菌属、副萨特菌属、Intestinimonas、互养菌属、柯林斯氏菌属、Barnesiella和Odoribacter相对丰度明显提高。研究表明,AhR活化可调控仔猪结肠肠道菌群组成及短链脂肪酸的合成,缓解LPS诱导的肠道微生物屏障损伤。关键词:芳香烃受体;豆蔻明;6-甲酰基吲哚并3,2-B咔唑;断奶仔猪;肠道菌群;短链脂肪酸中图分类号:S828文献标识码:A文章编号:10 0 2-2 8 13(2 0 2 3)2 0-0 0 18-0 7Doi:10.13557/ki.issn1002-2813.2023.20.004Effect of AhR activ
4、ation on intestinal floraand short-chain fatty acid content in immune stressed pigletsWU Xiao-meiJI Meng-yaoYANGWenFANGYiDENG Tan-jieAN Zhao-xiangZHANGYa-leiXUN Wen-juanAbstract:The study aimed to investigate the effect of AhR activation on intestinal flora and short-chain fatty acidcontent in immun
5、e-stressed piglets.A total of 24 weaned piglets(Duroc Landrace Yorkshire)with good health andsimilar weight at 21 d were randomly assigned into four groups with six replicates in each group and one pig in eachreplicate.Piglets in control group(CON)were fed with a basal diet,and piglets in LPS stress
6、 group(LPS)wereintraperitoneally injected with 100 g/kg BW LPS before slaughter.Piglets in FICZ group(FICZ)were intraperitoneallyinjected with 250 g/kg FICZ+LPS before slaughter,and piglets in CDN group(CDN)were intraperitoneally injectedwith 6 mg/kg CDN+LPS before slaughter.The experiment lasted fo
7、r 15 d.The results showed that compared with LPSgroup,the content of propionic acid,butyric acid and valeric acid of FICZ group increased significantly(P0.05),theChaol index and Observed species index in CDN group increased significantly(P0.05),and valeric acid increased.Compared with LPS group,at t
8、he phylum level,the relative abundance of Cyanobacteriain in FICZ group and CDN groupincreased significantly and the relative abundance of Firmicutes decreased significantly.At the genus level,the relativeabundance of Anaerotruncus,Cloacibacillus,Alistipes,Halomanas,Aeromicrobium,Sediminispirochaeta
9、,Paraprevotella,Faecalicoccus,Parasutterella,Intestinimonas,Synergistes,Collinsella,Barnesiell and Odoribacter was significantly increasedin FICZ group and CDN group.The study indicates that AhR activation can regulate the composition of colonic microbiotaand the synthesis of short-chain fatty acids
10、 in piglets,and alleviate LPS-induced intestinal microbial barrier damage.第一作者:吴小妹,硕士,研究方向为动物营养。通信作者:荀文娟,副教授,硕士生导师。基金项目:国家自然科学基金地区基金项目(项目编号:32060757)收稿日期:2 0 2 3-0 5-31Key words:AhR;cardamomin;FICZ;weaned piglets;intestinal flora;short-chain fatty acids断奶应激是仔猪早期断奶产生的一系列综合征,可激活相关炎症通路引起肠道炎症反应,导致肠道菌群及2
11、.NO.202023饲料研究FEEDRESEARCH19猪营养代谢物组成发生改变,从而诱导仔猪发生腹泻。脂多糖(LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的组成成分,可激活TLR4通路引起炎症反应,导致肠道屏障损伤及功能障碍2 。芳香烃受体(AhR)是一种由配体激活的转录因子,在调节肠道菌群、减轻肠道炎症以维持肠道功能中发挥重要作用3-4。6-甲酰基吲哚并3,2-B咔唑(6-Formylindolo3,2-bcarbazole,FICZ)作为AhR的内源性配体,可通过激活AhR有效的调节肠道菌群失调,抑制肠道炎症以及保护肠道屏障5-。研究表明,FICZ可通过激活AhR显著改善小鼠抗生素诱导的肠道菌群耗竭,恢
12、复至与粪菌移植相似的肠道菌群水平7 豆蔻明(cardamonin,CD N)是一种黄酮类查耳酮化合物的植物提取物8,具有抑菌抗炎、抗氧化、抗肿瘤及抗病毒等生物学活性9-12 。研究发现,CDN作为AhR外源性配体在缓解肠道炎症方面发挥重要调节作用13-14。此外,CDN对有害菌如幽门螺旋杆菌具有较强的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌等菌株也具有一定的抑菌活性5。但目前尚未见关于AhR活化通过调控肠道菌群保护断奶仔猪肠道健康的相关报道。本研究通过LPS建立仔猪免疫应激模型,研究AhR活化对免疫应激仔猪肠道菌群和短链脂肪酸的影响,为断奶仔猪肠道菌群的营养调控及豆蔻明作为饲料添加剂
13、的开发利用提供参考材料与方法1.1试验材料CDN购自南京景竹生物科技有限公司,纯度9 8%,FICZ购自上海易恩化学技术有限公司,纯度9 8%,LPS购自Sigma公司,纯度9 9%。1.2试验设计及饲养管理试验选取断奶仔猪2 4头,随机分为4组,每组6 个重复,每个重复1头猪。对照组(CON)为基础日粮,LPS应激组(LPS)仔猪屠宰前腹腔注射10 0 g/kgBWLPS,FICZ组(FICZ)仔猪腹腔注射2 50 g/kgFICZ+屠宰前注射LPS,CD N组(CDN)仔猪腹腔注射6 mg/kgCDN+屠宰前注射LPS。仔猪自由采食、饮水,正式试验期15d。从试验第8 d开始,FICZ、C
14、D N组仔猪每天腹腔注射FICZ或CDN(均用无菌生理盐水和少量的DMSO配制),其余两组注射等量无菌生理盐水。试验第15d,除CON组外,其余试验组仔猪腹腔注射LPS(10 0 g/kgBW),CO N组仔猪注射等量生理盐水。注射6h后所有仔猪屠宰,采集结肠内容物样品-8 0 保存,用于分析微生物群组成及测定短链脂肪酸含量,基础日粮组成及营养水平见表1。1.3测定指标及方法1.3.1肠道菌群多样性分析肠道样品送至北京奥维森基因科技有限公司,使用高通量测序技术对结肠内容物进行16 SrRNA基因测序。表1基础日粮组成及营养水平(风干基础)原料组成含量/%营养水平玉米55.70消化能/(MJ/k
15、g)14.57豆粕18.80粗蛋白质/%20.22膨化大豆8.50钙/%0.79鱼粉5.50总磷/%0.66乳清粉4.50赖氨酸/%1.52豆油1.90蛋氨酸/%0.50煎糖1.88苏氨酸/%0.86磷酸氢钙0.70色氨酸/%0.29石粉0.60L-赖氨酸0.33DL-蛋氨酸0.14L-苏氨酸0.05L-色氨酸0.05食盐0.35预混料1.00合计100.00注:1.预混料为每千克饲粮提供:VA9000IU、VD,12 0 0 IU、VE6 5IU、VK,2.5mg、VB,2.5mg、VB,6.0 mg、VBz 0.0 3mg、叶酸1.5mg、烟酸2 5mg、泛酸2 2 mg、生物素0.2 m
16、g、铜8 0 mg、铁12 0 mg、锰45mg、锌12 0 mg、硒0.3mg、碘0.3mg。2.营养水平中消化能为计算值,其余均为实测值。1.3.2短链脂肪酸含量结肠内容物短链脂肪酸含量采用气相色谱仪(安捷伦7 8 9 0 BAgilent)测定。称量2 g结肠内容物,加入含有2mL预冷ddH,O中,振荡混匀。4、150 0 0 r/min离心10min,取上清液1.5mL加入0.3mL25%偏磷酸溶液混匀,冰浴30 min,再次4、150 0 0 r/min离心10 min取上清液,经0.2 2 m滤膜过滤于进样瓶中。色谱条件:色谱柱(HP-INNOWAX,30 m 250m0.25m)
17、,载气为氮气,总流量为2 5mL/min,进样口为分流模式,分流比10:1,加热器温度2 2 0,样品进样量1uL1.4数据统计与分析数据采用SPSS21进行单因素方差分析,Duncans法组间多重比较。肠道菌群多样性分析分别采用图基检验、偏最小二乘法判别分析、组间显著性差异分析(m e t a s t a t s)分析各组间多样性指数和多样性以及门(属)水平上的组间差异,LDAeffect size(LEf Se)分析获得显著差异且影响力大的差异菌属。P0.01表示差异极显著,P0.05)。与LPS组相比,FICZ组的Chaol、PD _w h o le _t r e e 指数呈升高趋势(P
18、0.05);CDN组Chaol指数极显著升高(P0.01)、O b s e r v e d _species指数显著升高(P0.05)。由图1(c)可知,Shannon-Wiener曲线可反映各样本在不同测序深度时的微生物多样性,图中曲线趋向平坦,表明测序数据量足够大,可反映样本中绝大多数的微生物信息由图1(d)可知,Specaccum物种累积曲线可在反映样本量是否充分的基础上对物种丰富度进行预测;在一定范围内,随着样本量加大,曲线表现趋于平缓,表示此环境中的物种并不会随样本量的增加而显著增多。2.1.2仔猪结肠菌群多样性分析斤(见图2)多样性反映不同测序样本之间的微生物物种多样性情况。本研究
19、基于OTU的偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)。由图2 可知,4组间的仔猪结肠菌群结构差异明显。FICZ组与LPS组的OTU聚类较远,CDN组与LPS组的OTU聚类也较远,表明FICZ组、CDN组与LPS组间的仔猪结肠菌群结构存在明显差异。2.1.3仔猪结肠菌群组成及相对丰度分析(见图3)图3(a)、图3(b)分别为相对丰度排名前2 0 的优势菌门、菌属。由图3(a)可知,厚壁菌门(Fi r m i c u t e s)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Pr o t e o b a c t e r i a)为仔猪结肠相对丰度最高的3个优势菌门,其中Firmicutes占比最
20、多,Bacteroidetes和Proteobacteria次之。与LPS组相比,FICZ组仔猪结肠WPS-2、Sy n e r g i s t o t a、疣微菌门(Verrucomicrobiota)、螺旋体门(Spirochaetota)、蓝藻门(Cyanobacteria)相对丰度明显增加,Firmicutes的相对丰度明显降低;CDN组仔猪结肠放线菌门(Actinobacteriota)、脱硫菌门(Desulfobacterota)、Sy n e r g i s t o t a、Ve r r u c o mi c r o b i o t a、Cyanobacteria的相对丰度明显增
21、加,Firmicutes和Patescibacteria的相对丰度明显降低。由图3(b)可知,与LPS组相比,FICZ组仔猪结肠的Clostridium_sensu_stricto_1明显降低,而CDN组的普氏菌属相对丰度明显减少。由图3(c)m e t a s t a t s 分析结果可知,与LPS组相比,FICZ组和CDN组仔猪结肠Anaerotruncus、梭状芽孢杆菌属(Cloacibacillus)、阿利斯佩斯菌属(Alistipes)、盐单胞菌属(Halomonas)、气微菌属(Aeromicrobium)、Sediminispirochaeta、帕拉普菌属(Paraprevote
22、lla)、粪球菌属(Faecalicoccus)、副萨特菌属(Parasutterella)、Intestinimonas、互养菌属(Synergistes)、柯林斯氏菌属(Co l l i n s e l l a)、Ba r n e s i e l l a 和Odoribacter的相对丰度均明显提高,Moryella相对丰度明显降低。LPS组FICZ组283460CON组59CDN组1896.336151541445831701.3606628714297(a)Venn图2.5002.500*2.0002.000*1500150010001000)CON组LPS组FICZ组CDN组CON组
23、LPS 组FICZ组CDN组组别组别(bl)Chaol指数(b2)Observed_species指数200*7.51.50*7.01006.5506.005.5CON组LPS组FICZ组CDN组CON组LPS组FICZ组CDN组组别组别(b3)PD_whole_tree指数(b4)Shannon指数(b)多样性指数箱式图6CDN_1FICZ1CDN_2FICZ_25CDNL3FICZ_3CDN_4FICZ_4CDNL5FICZL5CDN_6FICZ_63CON1LPS_1CON_2LPS_22CON_3LPS3CON_4LPS_41CON_5LPS5CON_6LPS_624681012样本数
24、量/10 t(c)Shannon-Wiener曲线60005000Sn.LO40003.00020001.0000510152025测序样本数(d)Sp e c a c c u m 物种累积曲线注:“*表示差异显著(P0.05),“*”表示差异极显著(P0.01)。图1结肠菌群OTUs及多样性分析NO.202023饲料研究FEEDRESEARCH21猪营养60CDN组+CON组40+FICZ组+LPS组(%08S)z0d200-20-60-3003060PC1(9.17%)图2仔猪结肠菌群多样性分析100Othersp_ElusimicrobiotaP_WPS-2Punidentifiedp_
25、Thermoplasmatota75P_Acidobacteriotap_Fibrobacterota%丰pSynergistotap_Verrucomicrobiotap_Deferibacterotap_Cyanobacteria50p_Patescibacteriap_FusobacteriotaP_DesulfobacterotapCampilobacterotap_Euryarchaeota25p_Actinobacteriotap_Spirochaetotap-Proteobacteriap_Bacteroidotap_Firmicutes0CON组LPS组FIZC组CDN组组别(
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