防己黄芪汤对气虚水负荷模型大鼠的利尿作用及对肾脏AQP1-4表达的影响.pdf
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1、第 41 卷 第 5 期2023 年 10 月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University(Natural Science)Vol.41 No.5Oct.2023收稿日期:2022-05-27 基金项目:山西省自然基金项目(201901D111338);山西中医药大学科技创新能力培育计划项目(2019PY-120);山西中医药大学研究生创新创业项目(2021CX010)作者简介:高丽(1977),女,副教授,从事方剂效用及其物质基础研究,e-mail:342014263 。DOI:10.13880/ki.65-1174/n.2023.22.032文章编
2、号:1007-7383(2023)05-0615-07防己黄芪汤对气虚水负荷模型大鼠的利尿作用及对肾脏 AQP14 表达的影响高丽,严文允,李茹超,魏楠楠,周文静,白赟(山西中医药大学,山西 晋中 030619)摘要:目的 观察防己黄芪汤对气虚水负荷模型大鼠的利尿作用及肾脏水通道蛋白(Aquaporin,AQP)1 4 表达的影响。方法 采用“游泳疲劳+饮食失节”复合因素诱导制备气虚大鼠模型,生理盐水造成水负荷状态,设防己黄芪汤低、中、高剂量组,另设空白对照组,每组 10 只。观察各组大鼠一般状态及体重变化,用显微镜观察各组大鼠的肾脏病理变化,Real-Time PCR 法和 Western
3、Blot 法检测各组大鼠肾脏 AQP14 的 mRNA 和蛋白表达。结果 给药后,与模型组比较,防己黄芪汤中、高剂量组一般状态良好,体重明显增长(P0.05)。肾脏病理检测结果显示,模型组有肾小管扩张化,其余各组未见异常变化。Real-Time PCR 和 Western Blot 结果显示,与空白对照组比较,模型组大鼠肾脏组织 AQP 14 mRNA 和蛋白表达明显升高(P0.05);与模型组比较,防己黄芪汤中、高剂量组大鼠肾组织AQP 14 mRNA 和蛋白表达明显降低(P0.05)。结论 防己黄芪汤对气虚水负荷模型大鼠有明显的利尿作用,这可能与下调肾 AQP 14 的 mRNA 和蛋白表
4、达有关。关键词:防己黄芪汤;气虚;盐水负荷;水通道蛋白;利尿作用中图分类号:R285.5文献标志码:ADiuretic effect and the expression of AQP14 in kidney of Fangji Huangqi decoction on rats with Qi-deficiency and saline-loadingGAO Li,YAN Wenyun,LI Ruchao,WEI Nannan,ZHOU Wenjing,BAI Yun(Shanxi University of Traditional Chinese Medicine,Jinzhong,Sha
5、nxi 030619,China)Abstract:Objective The study was to observe the diuretic effect and the expression of Aquaporin(AQP)1 4 in kidney of Fangji Huangqi Decoction on rats with Qi-deficiency and saline-loading.Methods The model rats of Qi-deficiency were established by com-posite factors of exhaustive sw
6、imming and intemperance of taking food,which were given saline by intragastric administration.The model rats were randomly divided into model group and medication groups(high,middle and low dosage)of Fangji Huangqi Decoc-tion.Another blank group was controlled.The changes of general state and body w
7、eight of rats in each group were observed.The path-ological changes of kidneys were observed by microscope.Real-Time PCR was used to detect mRNA expression of AQP 1 4,and Western Blot was used to detect protein expression of AQP 1 4 in kidneys.Results After administration,compared with the model gro
8、up,the middle and high dose groups of Fangji Huangqi Decoction were generally in good condition and their body weight increased significantly(P0.05).Renal pathological examination showed that tubule expansion could be observed in the model group,while no obvious abnormal changes in the other groups.
9、Compared with blank group,mRNA and protein expression of AQP 14 in model group were increased significantly(P0.05).Compared with the model group,mRNA and protein expression of AQP 1 4 in middle and high dose group of Fangji Huangqi Decoction were decreased significantly(P0.05).Conclusion Fangji Huan
10、gqi decoction could sig-nificantly improve and regulate water metabolism in rats of Qi-deficiency and Saline-loading,and down-regulating mRNA and protein expression of AQP 14 in renal might be one of its action mechanisms.Key words:Fangji Huangqi decoction;Qi deficiency;saline loading;aquaporin;diur
11、etic effect616 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷防己黄芪汤是源自金匮要略的经典名方,由防己、黄芪、白术、炙甘草、生姜、大枣组成,功效益气健脾,利水消肿。根据方证相关理论,防己黄芪汤正对气虚水肿之证。临床上,防己黄芪汤加减用来治疗多种水液代谢相关疾病,如肾病综合征1、心力衰竭2、高血压3等,凡辨证属气虚的,均疗效显著。现代研究发现水通道蛋白(aquaporin,AQP)是位于细胞膜上的一种特殊蛋白,负责运输水及一些小分子通过细胞内外,具有高度选择性,以维持组织器官甚至全身水平衡。目前为止,已发现 13 种同工型 AQP,在 肾 脏 中 发 现 9 种(AQP1 AQP8 和
12、AQP11),其中,AQP1 4 在尿液形成中起着重要作用。故本实验选择气虚水负荷模型大鼠来研究防己黄芪汤对肾 AQP14 表达的影响,以期为防己黄芪汤的临床应用和理论研究提供实验依据。1 材料与方法1.1材料 1.1.1实验动物Wistar 大鼠 70 只,SPF 级,雄性,体重(20020)g,购买于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号 SCXK(京)2016-0006。1.1.2仪器与设备TE612-L 电子天平(梅特勒-托利台仪器上海有限公司),KDC-OHR 高速冷冻离心机(安徽中科中佳科技仪器有限公司),Spectra Max190 型酶标仪(美国,MD 公司),Imag
13、eQuant LAS 500 一体化成像仪(美国 GE 公司),BG-PS 电泳仪(生工生物工程(上海)股份有限公司),QuantStudioTM5 荧光定量PCR 仪(赛默飞)。1.1.3药品与试剂黄芪饮片购自安徽精诚本草中药饮片有限公司,批号为 20201001,防己饮片、炙甘草饮片、白术饮片购自北京同仁堂股份有限公司,批号分别为 20200801、20201001、20201201。Na、K、Cl 测试盒购自南京建成生物工程研究所,批号分别为 20211123、20211110、20211029。AQP1、AQP2 抗体、HRP-羊抗兔 IgG 均购自 博 士 德 公 司,批 号 分 别
14、 为ZP2009BP09、ZP2010BP10、BST16I26C16J54;AQP3、AQP4 抗体均购自 ABclonal,批号分别为 0058560102、0073660202。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.2方法1.2.1气虚模型的建立实验前全部动物进行负重(在鼠尾缠绕约体重7%的铁丝)游泳,水温 202 ,筛选时长为 10 30 min 内的动物继续实验。按照数字随机法将大鼠分为两组,正常组和气虚模型组。其中正常组按常规喂养,不做任何处理;气虚模型组参照中药治疗脾虚证的临床研究指标原则4和 中医湿病学5,采用“游泳疲劳+饮食失节”复合因素诱导建立。具体操作为采用隔日
15、禁食、隔日给食及每日负重游泳,直至口鼻没入水中 34 s 捞出,连续 4 周。1.2.2防己黄芪汤的制备防己黄芪汤参照原书比例,按防己:黄芪:白术:甘草=4 5 3 2进行前煮,煎煮时再加入生姜、大枣。将药材以 10 倍体积的水浸泡 2 h,用武火煮沸,继续文火煎煮 30 min。第二次用 8 倍水体积浸泡,以相同方法煎煮,合并两次的过滤液,蒸馏浓缩至所需要的浓度。静置冷却后放入 4 冰箱保存备用。1.2.3实验分组与给药造模成功后,将 40 只气虚水负荷模型大鼠按照数字随机法分为 4 组,即模型组、防己黄芪汤低剂量组、防己黄芪汤中剂量组、防己黄芪汤高剂量组,每组 10 只。另设空白对照组 1
16、0 只。各组大鼠分别按2 mL/100 g 的灌胃体积进行灌胃。空白对照组、模型组大鼠灌服生理盐水;防己黄芪汤低、中、高剂量组分别灌服为 2.20、4.40、8.80 gkg-1的剂量防己黄芪汤,连续 7 天。1.2.4标本采集与保存每组大鼠按生理盐水 50 mL kg-1灌胃造成水负荷,30 min 后,收 集 每 小 时 尿 液,连 续 收 集 6 h。3 000 r min-1离心 15 min,取上清,进行尿 Na+、K+、Cl-含量 测 定 pH 值 的 测 定。尿 液 收 集 结 束 后 以10%水合氯醛麻醉各组大鼠,摘取肾脏,除去包膜,把一侧放入装有组织固定液的标本瓶中固定,以制
17、备病理切片;另一侧置于-80 冰箱保存,以备 Na+-K+-ATP 酶检测和 RNA 及蛋白质的提取。1.2.5肾 Na+-K+-ATP 酶活力的检测取肾组织放入匀浆管中,加入 0.9%的生理盐水作为匀浆介质,制成 10%的匀浆液,用低速离心机2 500 r min-1离心 10 min,取上清按说明书进行测定。1.2.6蛋白免疫印迹法检测大鼠肾组织 AQP14的蛋白表达取适量肾组织,加入蛋白裂解液,匀浆制备肾组织蛋白匀浆液,用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白浓度。稀释至同一浓度进行蛋白变性,上样,跑电泳,转膜,用含 5%脱脂奶粉的 TBST 封闭液进行封闭 2 h;加入含 AQP1、AQ
18、P2、AQP3、AQP4 一抗、-第 5 期高丽,等:防己黄芪汤对气虚水负荷模型大鼠的利尿作用及对肾脏 AQP14 表达的影响617 actin 内参的 TBST 稀释液进行 4 孵育过夜;摇床洗脱 3 次/10 min;加入含二抗(1 5 000)TBST 稀释液继续孵育 1 h,摇床洗脱 3 次/10 min;用化学发光试剂和一体化成像仪进行显影曝光,用 image-j 分析其灰度值。1.2.7Real Time-PCR 检测大鼠肾组织 AQP14的 mRNA 表达 取适量肾组织,按照 RNA 快速提取试剂盒提取RNA,用紫光分度计检测其浓度。稀释至同一浓度,按照试剂盒进行反转录实验,再进
19、行 Real-Time PCR扩增,实验步骤严格按照说明书进行。表 1AQP14 引物设计名称序列AQP1-FCCTGCTGGCGATTGACTACACTGAQP1-RTGGTTTGAGAAGTTGCGGGTGAGAQP2-FCTTCCTTCGAGCTGCCTTCTATGTGAQP2-RGCTGTGGCGTTGTTGTGGAGAGAQP3-FGCTGTCACCCTTGGCATCTTGGAQP3-RAGGAAGCACATTGCGAAGGTCACAQP4-FCAGCATCGCTAAGTCCGTCTTCTACAQP4-RACCGTGGTGACTCCCAATCCTC1.2.8统计学方法应用 SPSS
20、22.0 统计软件进行分析,各组数据服从正态分布用均数标准差(X-S)表示,组间差异的比较采用单因素方差分析,在方差齐的情况下,多组间比较采用 LSD-t 检验,方差不齐的情况下,用Dunnetts T3 作进一步的分析。以 P0.05 有统计学意义。2 结果2.1大鼠一般状况的观察空白对照组大鼠食欲好,反应灵敏,皮毛光泽,大便正常,一般情况良好。气虚模型组大鼠第 1 周开始出现食量下降,第 2 周出现倦怠少动、眼睛迷离、自主活动降低、蜷缩,皮毛少光;第 3 周开始出现皮毛干枯、蓬乱,粪便时软时溏;第 4 周时,大鼠身体瘦弱,精神不振,眯眼,弓背,爪色及耳色偏淡。大鼠体重、6 h 总尿量、游泳
21、时长结果见表 2。表 2气虚模型大鼠体重、尿量、游泳时长的情况(x-s)分组n体重/g6 h 总尿量/mL游泳时长/min空白对照组10365.9325.1711.121.9924.822.74气虚模型组40194.7313.84a4.351.65a11.632.58a注:与空白对照组比较,aP0.01。给药治疗后,与模型组相比,防己黄芪汤各组大鼠的食欲渐增、精神状态良好、粪便形态有所改善,皮毛不似之前干枯。与模型组比较,防己黄芪汤各组的体重有所增加,结果见表 3。表 3防己黄芪汤对气虚水负荷模型大鼠体重的影响(x-s,n=10)分组剂量/(g kg-1)体重/g空白对照组-377.1729.
22、20模型组-213.2718.04a防己黄芪汤低剂量组2.20218.1317.41a防己黄芪汤中剂量组4.40240.6119.69abc防己黄芪汤高剂量组8.80241.6219.40abc注:与空白对照组比较,aP 0.05;与模型组比较,bP0.05;与防己黄芪汤低剂量组比较,cP0.05。2.2对大鼠各时间点及 6 h 总尿量的影响与模型组比较,防己黄芪汤各剂量组在第 2 h的尿量明显增加(P0.05),中剂量组在第 2、3 h 的尿量明显增加(P0.05),高剂量组在第 2 h 至第 6 h 的尿量持续明显增加(P0.05)。与空白对照组比较,模型组、防己黄芪汤低、中剂量组 6 h
23、 总尿量明显减少(P0.05);防己黄芪汤高剂量组大鼠的 6 h 总尿量明显增加(P0.05)。与模型组比较,防己黄芪汤中、高剂量组大鼠的 6 h 总尿量明显增加(P0.05),结果见图 1。A:空白对照组,B:模型组,C:防己黄芪汤低剂量组,D:防己黄芪汤中剂量组,E:防己黄芪汤高剂量组;与空白对照组比较,aP0.05;与模型组比较,bP0.05;与防己黄芪汤低剂量组比较,cP0.05;与防己黄芪汤中剂量组比较,dP0.05。图 1防己黄芪汤对气虚水负荷模型大鼠的各时间点及 6 h 总尿量变化618 石河子大学学报(自然科学版)第 41 卷2.3对大鼠尿液 Na+、K+、Cl-含量和 pH
24、值的影响与空白对照组比较,模型组大鼠尿 Na+、K+、Cl-含量明显降低(P0.05),防己黄芪汤低剂量组大鼠的尿 Na+、Cl-含量明显降低(P0.05)。与模型组比较,防己黄芪汤中、高剂量组大鼠的尿 Na+、Cl-含量明显升高(P0.05);防己黄芪汤高剂量组大鼠的尿 K+含量明显升高(P 0.05),结 果 见图 2。A:空白对照组,B:模型组,C:防己黄芪汤低剂量组,D:防己黄芪汤中剂量组,E:防己黄芪汤高剂量组;与空白对照组比较,aP0.05;与模型组比较,bP0.05;与防己黄芪汤低剂量组比较,cP0.05;与防己黄芪汤中剂量组比较,dP0.05。图 2防己黄芪汤对气虚水负荷模型大
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