二甲双胍减轻阿霉素诱导的心脏毒性:基于AMPK通路.pdf
《二甲双胍减轻阿霉素诱导的心脏毒性:基于AMPK通路.pdf》由会员分享,可在线阅读,更多相关《二甲双胍减轻阿霉素诱导的心脏毒性:基于AMPK通路.pdf(7页珍藏版)》请在文库网上搜索。
1、二甲双胍减轻阿霉素诱导的心脏毒性二甲双胍减轻阿霉素诱导的心脏毒性:基于基于AMPKAMPK通路通路魏 佳,杨 强,林 琳,朱参战,魏 瑾西安交通大学第二附属医院心内科,陕西 西安 710004Metformin mitigates doxorubicin-induced cardiotoxicity via the AMPK pathwayWEI Jia,YANG Qiang,LIN Lin,ZHU Canzhan,WEI JinDepartment of Cardiology,Second Affiliated Hospital of Xian Jiaotong University,Xia
2、n 710004,China摘要:目的 探究AMPK通路是否以及如何影响二甲双胍调节体内阿霉素心脏毒性的能力。方法 临床研究:以123例使用阿霉素进行阶段性化疗的髓系白血病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌患者为研究对象,其中80例未联用二甲双胍(对照组),43例联用二甲双胍(200 mg/d,试验组)治疗。首先对两组患者进行基线资料对比,再使用自身对照及组间对照方法,回顾分析两组患者用药前后心肌损伤指标血浆肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平、乳酸脱氢酶(LDH)水平及心衰相关指标血浆B型钠尿肽(BNP)、左心室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)等的变化。基础研究:以24只6周龄AMPK2基因敲除小
3、鼠(AKO)为研究对象,24只6周龄C57BL/6野生型小鼠(WT)为对照,将AKO组和WT组小鼠组内再随机分为4组,分别是对照组(Con)、二甲双胍组(MET)、阿霉素组(DOX)及二甲双胍联合阿霉素组(MET+DOX),6只/组。对上述各组小鼠行血清LDH、肌钙蛋白I(cTnI)、心肌细胞凋亡水平检测,心功能FS测定。结果 临床研究结果:两组患者化疗前血CK-MB、LDH、BNP水平及左心室EF、FS值无差别。化疗后对照组血CK-MB、LDH及BNP水平显著高于化疗前,EF及FS显著低于化疗前(P0.05);而试验组血CK-MB、LDH及BNP水平明显低于化疗前(P0.05)。比较两组患者
4、化疗后上述指标发现,试验组患者化疗后血CK-MB、LDH及BNP水平明显低于对照组,EF值及FS值明显高于对照组(P0.05)。基础研究结果:心功能检测结果显示,阿霉素单药干预可使两组小鼠FS均显著降低,但AKO组FS降低程度轻于WT组(P0.05);二甲双胍与阿霉素共同干预,可使WT组降低的FS有所提高(P0.05),但对AKO组降低的FS无明显改善;血清学指标检测结果显示,阿霉素单药干预可使两组小鼠LDH和cTnI均显著升高,但AKO组升高程度轻于WT组(P0.05);二甲双胍与阿霉素共同干预,可使WT组小鼠升高的LDH和cTnI有所降低(P0.05);心肌细胞凋亡水平检测结果显示,阿霉素
5、单药干预可使两组小鼠心肌细胞凋亡水平显著升高(P0.01),但AKO组细胞凋亡程度轻于WT组(P0.05)。结论 阿霉素在临床应用时可能引起患者心脏毒性作用,阿霉素联合二甲双胍后在一定程度减轻了心脏毒性,AMPK可能在二甲双胍抗阿霉素心脏毒性时发挥作用。关键词:阿霉素;心脏毒性;二甲双胍;AMPK通路Abstract:Objective To explore whether metformin reduces cardiotoxicity of doxorubicin through the AMPK pathway.Methods We analyzed the data of 123 pa
6、tients with myeloid leukemia,non-Hodgkins lymphoma,or breast cancer receivingdoxorubicin for phased chemotherapy,including 43 patients receiving combined treatment with metformin(test group)and 80without metformin treatment(control group).The changes in plasma levels of CK-MB,LDH,and BNP,left ventri
7、cular ejectionfraction(EF)and left ventricular fractional shortening(FS)of the patients were observed.The effect of treatments withmetformin and doxorubicin,alone or in combination,on myocardial damage,cardiac function and myocardial cell apoptosiswere also observed in C57BL/6 mice with AMPK2 gene k
8、nockout(AKO).Results CK-MB,LDH and BNP levels increasedand EF and FS decreased significantly in the control group after chemotherapy(P0.05).In the test group,CK-MB,LDH andBNP levels were significantly lowered after the combined treatment(P0.05).CK-MB,LDH and BNP levels were lower and EF and FS were
9、higher significantly in the test group than inthe control group after the treatment(P0.05).Doxorubicin treatment reduced FS in both wild-type and AKO mice,but thereduction was less obvious in AKO group(P0.05).The combined treatment restored FS in wild-type mice(P0.05)but not inAKO mice.Doxorubicin s
10、ignificantly increased LDH and cTnI levels in both wild-type and AKO mice,but with smallerincrements in the latter(P0.05);The combined treatment with metformin reduced doxorubicin-induced elevation of LDH andcTnI levels in the wild-type mice(P0.05).Doxorubicin increased myocardial cell apoptosis inb
11、oth mice(P0.01)but less strongly in AKO mice(P0.05).Conclusion Chemotherapy with doxorubicin causes cardiotoxicity,which can be mitigated by combined treatment with metformin possibly through a mechanism involving the AMPK pathway.Keywords:doxorubicin;cardiotoxicity;metformin;AMPK阿霉素(DOX)又名多柔比星,是一种作
12、用于人体DNA的药物,从而阻断肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡。广泛使用于化学治疗,其属于蒽环类抗生素家族 1。然而阿霉素在临床使用时会产生不可逆的甚至可能危及生命的心脏损伤,包括各种类型的心律失常、心包及收稿日期:2023-04-20基金项目:陕西省自然科学基础研究计划青年项目(2020JQ-538)作者简介:魏 佳,硕士,住院医师,E-mail:;杨 强,博士,主治医师,E-mail:str_。魏 佳、杨 强共同为第一作者通信作者:魏 瑾,博士,主任医师,E-mail:doi 10.12122/j.issn.1673-4254.2023.10.05J South Med Univ,2023,43
13、(10):1682-16881682心肌炎、急性高血压、充血性心力衰竭甚至死亡,这导致临床实践中对这些药物的使用受到限制 2。尽管经过了近60年的研究,阿霉素引起的心脏毒性的机理仍未被完全理解,涉及不同的潜在途径,从而导致心肌细胞死亡 3。近年来研究发现,降糖药二甲双胍可降低阿霉素心脏毒性 4,5 并增加其抗癌活性 6。其中涉及到体内一种重要的能量代谢通路腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路 7。然而,现有研究却存在一些争议,如在恒河猴实验使用AMPK的激活剂MK8722(其是一种对12种哺乳动物AMPK通路的直接变构激活剂)后发现使用MK8722可引起心脏肥大,大鼠实验中给药6个月后心脏质量的
14、增加比给药1个月后更大(表现为心电图QRS振幅增加)8。而目前对于二甲双胍抗阿霉素心脏毒性的疗效及其分子机制尚不明确。因此,我们拟从以下几个方面进行初步探讨:二甲双胍对于阿霉素引起的心脏毒性过程中起何种作用;二甲双胍在对于阿霉素心脏毒性的保护作用是否通过AMPK通路;AMPK通路在阿霉素心脏毒性中的作用是有利的还是有害的。如何改善和治疗阿霉素所致的心脏毒性一直是医学领域所关注的热点,本研究拟为二甲双胍防治阿霉素性心脏毒性提供一定的理论与实践依据。1 资料和方法1.1 临床研究1.1.1 研究对象 西安交通大学第二附属医院2016年1月2019年1月就诊的髓系白血病、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌联合使
15、用阿霉素(盐酸表柔比星60 mg/m2或盐酸吡柔比星20 mg/m2或盐酸多柔比星50 mg/m2)进行阶段性化疗患者共123例为研究对象。其中43例联用二甲双胍(200 mg/d,试验组),80例未联用二甲双胍(对照组),对医疗数据库中记载的医疗记录及病历文件进行了回顾性分析。本研究为回顾性研究,已获批西安交通大学第二附属医院伦理委员会批准(2023308)。1.1.2 排除标准 合并2型糖尿病使用二甲双胍者、联合服用抗心律失常药物或受体阻滞剂等药物者。1.1.3 研究方法 首先对两组患者进行基线资料对比,再使用自身对照及组间对照方法,回顾分析两组患者用药前后心肌损伤指标血磷酸肌酸激酶同工酶
16、(CK-MB)水平、乳酸脱氢酶(LDH)水平及心衰指标血B型钠尿肽(BNP)水平、左心室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)等的变化。1.1.4 质量控制 本研究中患者心脏彩超由我院超声研究室专业医师进行测量校对,血液资料均由所在科室专业护士一对一采集,统一送往我院检验科进行分析,使用贝克曼生化分析仪进行检测。根据ISO15189 医学实验室-质量和能力的要求 检测心肌损伤及心衰相关指标,检测项目参加卫生部临检中心室间质量评价合格,室内质量控制日常开展并处于在控状态。1.1.5 统计学分析 用Excel收集数据,使用SPSS 18.0软件进行统计分析。上述心肌损伤指标及心衰指标以均
17、数标准差表示,数据服从正态分布,组内前后比较及组间两两比较均采用t检验,使用Graphpad Prism 9.0软件作图,P0.05时认为差异具有统计学意义。1.2 基础研究以24只6周龄AMPK 2敲除(AKO)小鼠为实验对象,24只6周龄野生型C57BL/6小鼠(WT)为对照(其中雄性12只,雌性12只)。实验期间动物饲养于西安交通大学医学院动物房,实验方案获西安交通大学实验动物管理委员会批准(2021244),并采取相关措施避免动物在手术中的疼痛。动物房设置的标准是:室内湿度555,温度222 以及明暗交替各12 h。饲养笼透明,每笼小鼠不超过5个,小鼠可自由获取食物和水。1.2.1 研
18、究方法 将AKO组和WT组小鼠组内再随机分为4组,分别是对照组(Con)、二甲双胍组(MET)、阿霉素组(DOX)及二甲双胍联合阿霉素组(MET+DOX),6只/组。二甲双胍干预方法:MET组及MET+DOX组小鼠于实验第16天按200 mg/kg每日口服二甲双胍,Con组及DOX组不进行口服药物干预,自由获取水和食物;阿霉素干预方法:DOX组及MET+DOX组于实验第3天按20 mg/kg腹腔注射阿霉素,Con组及MET组腹腔注射等量生理盐水。各组小鼠于实验第6天麻醉后行心脏彩超检查,实验第7天处死小鼠,腹主动脉采血,并按要求留取血清及心脏组织。1.2.1.1 心脏彩超检测 应用Vevo21
19、00 型心脏超声诊断仪,于小鼠处死前1 d行心脏彩超检查。给小鼠吸入2%异氟烷麻醉,将小鼠固定在加热平台上,用脱毛膏去除胸毛,吸水纸擦去毛发,再用浸水脱脂棉擦干净皮肤,挤压耦合剂覆盖于胸腔部位,于胸骨旁左室长轴切面获得左心室M 型超声心动图,记录左室FS数值。1.2.1.2 血清及心肌组织的提取 实验第7天处死小鼠,使用预先消毒好的手术器械,予2%异氟烷持续吸入麻醉小鼠,57 min即可。使小鼠仰卧位固定于工作台,打开腹腔,暴露腹主动脉,使用消毒好的剪刀镊子分离腹主动脉,腹主动脉取血后血清静置30 min,随后使用离心机离心3000 r/min、15 min,再将血清样本放置于冰箱(-80 )
20、中。随后打开胸腔,分离心脏,迅速将心脏转移到冷却板上的培养皿中,摘取心脏后分离左心室,并用生理盐水冲洗干净,分为两部分,一部分存放于液氮中,随后放置于冰箱(-80)中。另一部分放入10%的福尔马林溶液固定24 h,常规石蜡包埋,用于形态学等实验。http:/www.j-J South Med Univ,2023,43(10):1682-168816831.2.1.3 免疫印迹法检测P-AMPK和AMPK2蛋白表达 采用组织裂解液抽提心肌组织总蛋白后,考马斯蓝染色法检测蛋白浓度;将变性蛋白样品行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后,转至聚偏氟乙烯膜。室温下经5%脱脂奶粉封闭1 h后,在P-A
21、MPK(1 3000)、AMPK2(1 1000)和-actin(1 20 000)抗体中室温孵育2 h;洗膜后,再在辣根过氧化酶标记的二抗(1 2000)室温孵育1 h。经化学发光剂显影曝光后,以-actin为内参,采用Image J软件分析系统扫描分析小鼠心肌组织中P-AMPK和AMPK2蛋白表达水平。磷酸化-AMPK、AMPK2、-actin单克隆抗体购于CST(货号:2535、2757、93473)。1.2.1.4 LDH和心肌肌钙蛋白I(cTnI)的检测血清LDH水平使用LDH ELISA试剂盒(购于上海碧云天生物技术有限公司进行检测。将存放在冰箱(-80)中的血清样本取出,首先将小
22、鼠血清样品和LDH标准加入96孔板中,加入LDH测定缓冲液,每孔加48 L,在每个孔中加入50 L的混合物(混合物=48 LLDH测定缓冲液+2L血清样品),开始计3min后,然后用450nm扫描,读取波长,依照试剂盒要求进行公式计算出LDH水平。血清cTnI水平使用cTnI ELISA试剂盒(购于上海谷研实业有限公司,货号:GOY-2535E)进行检测。将存放在冰箱(-80)中的血清样本取出,使用96孔板,分别加入小鼠血清样品200 L,标准200 L,将平板放在摇床(150 r/min,25)上2 h,用弹性保鲜膜覆盖;然后进行第1次冲洗5次,每孔加入100 L稀释剂,每孔加入100 LH
23、RP酶结合物。再将平板放在摇床(150 r/min,25)上1h,用弹性保鲜膜覆盖;进行第2次冲洗5次,向每孔中加入100 LTMB溶液,用弹性保鲜膜覆盖,放置在摇床(150 r/min,25)上20 min,每孔加入100 L停止液,轻摇混合,当所有溶液由蓝色变成黄色,读出96孔板在450 nm的波长,依照试剂盒要求进行公式计算出cTnI水平。1.2.1.5 TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平 固定和透化:1525 下用固定液将组织切片固定20 min,在PBS溶液中浸泡30 min,将玻片在Triton X-100工作液中在冰上孵育25 min,在室温下孵育切片1 h;制备TUNEL反应混合
24、物:取出100 L标签溶液(样品瓶2)用于2个阴性对照,将总体积(50 L)的酶溶液(样品瓶1)添加到剩余的450 L标记溶液(样品瓶2)=总体积500 L,搅拌均匀;具体实验步骤:先小心吸出渗透溶液,用PBS冲组织切片2次,擦去多余的溶液以使切片干燥,在玻片切片上滴入50 L的Tunel反应混合物,再用封口膜将切片覆盖,将载玻片置于37 的潮湿环境中黑暗孵育1 h,用PBS冲洗玻片3次,擦去多余的溶液以使切片干燥,最后用荧光显微镜/共聚焦分析。1.2.2 统计学分析 以均数标准差表示数据整体分布情况,t检验用于两组数据之间的比较,单因素方差分析用于多组之间比较。GraphPad Prism
25、9.0 以及 SPSS18.0软件用来进行数据分析及作图。P0.05)。2.1.2 两组患者化疗前后各指标变化对比结果 80例对照组和43例试验组化疗前后心肌各指标变化(图1)。两组组内比较,对照组化疗后血CK-MB、LDH及BNP水平显著高于化疗前、EF及FS显著低于化疗前(P0.05);试验组化疗后血CK-MB、LDH及BNP水平明显低于化疗前(P0.05)。两组患者化疗后各指标比较,发现试验组患者化疗后血CK-MB、LDH及BNP水平明显低于对照组,EF值及FS值明显高于对照组(P0.050.050.050.050.050.050.050.05表1 两组患者基线资料对比Tab.1 Bas
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 二甲双胍 减轻 阿霉素 诱导 心脏 毒性 基于 AMPK 通路