分散固相萃取结合UPLC-MS_MS测定不同人参加工品中46种皂苷类化合物.pdf
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1、成分分析 食品科学 2023,Vol.44,No.18 305分散固相萃取结合UPLC-MS/MS测定不同 人参加工品中46 种皂苷类化合物王艳红1,吴雨桐2,曹虹芳3,许煊炜1,赵 丹1,李月茹1,*(1.吉林农业大学 农业农村部参茸产品质量监督检验测试中心,吉林 长春 130118;2.贵州中医药大学药学院,贵州 贵阳 550025;3.吉林农业大学中药材学院,吉林 长春 130118)摘 要:运用基质分散固相萃取净化,建立一种同时测定人参不同加工品中46 种皂苷类化合物的超高效液相色谱-质谱分析方法。样品经体积分数80%甲醇溶液超声提取,通过N-丙基乙二胺(primary seconda
2、ry amine,PSA)分散固相萃取净化后,采用KINETEX XB-C18色谱柱(2.1 mm100 mm,2.6 m)分离,以0.1%甲酸溶液(A)和乙腈(B)为流动相进行梯度洗脱,采用负离子多反应监测模式分析和外标法定量。结果表明,46 种皂苷类化合物在35 min内完成检测,在0.0250 g/mL质量浓度范围内有较好的线性关系,所对应的相关系数(R2)均大于0.99,方法检出限为0.43.2 mg/kg,定量限为1.410.5 mg/kg,在低、中、高3 个添加水平下的平均回收率为80.5%111.6%,相对标准偏差(relative standard deviations,RSD
3、)为1.3%6.8%。方法日内和日间精密度的RSD分别为0.5%4.5%(n=6)和1.1%6.6%(n=6),重复性的RSD在1.5%7.3%(n=6)之间,24 h内样品稳定性的RSD在0.9%5.8%(n=6)之间。方法优化了分散固相萃取剂的种类和用量,并考察分散固相萃取净化前后对基质效应的影响,结果表明,样品前处理通过PSA分散固相萃取净化,有效降低了基质效应,且操作简便、高效、节约成本。将该方法用于3 种不同人参加工产品生晒参、红参和黑参样品中46 种皂苷类化合物的分析测定,结果发现红参和黑参经过蒸制加工处理后,部分原有的皂苷发生了转化,产生了稀有皂苷,且黑参中产生的稀有皂苷含量远高
4、于红参。该方法准确可靠、快速、易操作,杂质干扰小,适合批量人参加工品中46 种皂苷类化合物的同时定量分析。关键词:人参;加工产品;皂苷类化合物;分散固相萃取;超高效液相色谱-质谱法Determination of 46 Ginsenosides in Different Processed Ginseng Products by Dispersive Solid Phase Extraction Combined with Ultra-high Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass SpectrometryWANG Yanhong1,WU
5、Yutong2,CAO Hongfang3,XU Xuanwei1,ZHAO Dan1,LI Yueru1,*(1.Ginseng and Antler Products Testing Center,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China;2.School of Pharmacy,Guizhou University of Traditional Chinese Medicine,Guiyang 550025,China;3.College o
6、f Traditional Chinese Herbal Medicines,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China)Abstract:A method was developed for the simultaneous detection of 46 ginsenosides in different processed ginseng products by dispersive solid phase extraction combined with ultra-high performance liquid chrom
7、atography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).The samples were ultrasonically extracted with 80%methanol aqueous solution,and the extract was purified by dispersive solid phase extraction(DSPE)using primary secondary amine(PSA)as a sorbent,separated on a KINETEX XB-C18 column(2.1 mm 100 mm,2.6 m)by
8、 gradient elution using a mobile phase consisting of acetonitrile and 0.1%formic acid aqueous solution,detected in the negative ion mode with multiple reaction monitoring(MRM),and quantified by an external standard method.The 46 ginsenosides were detected within 35 minutes.Under the optimized condit
9、ions,the calibration curves showed good linearities for 46 compounds at concentrations ranging from 0.02 to 50 g/mL with correlation coefficients(R2)over 0.99.The limits of detection(LODs)and the limits of quantitation(LOQs)were in the range of 0.43.2 mg/kg and 1.410.5 mg/kg,respectively.The average
10、 收稿日期:2022-10-16基金项目:吉林省科技发展计划项目(20210506009ZP)第一作者简介:王艳红(1974)(ORCID:0000-0003-1894-6614),女,副教授,博士,研究方向为农产品营养功能评价与质量安全。E-mail:yanhong-*通信作者简介:李月茹(1964)(ORCID:0000-0002-8323-6662),女,教授,博士,研究方向为农产品质量安全。E-mail:306 2023,Vol.44,No.18 食品科学 成分分析recoveries at three spiked levels were in the range of 80.5%1
11、11.6%with relative standard deviations(RSDs)of 1.3%6.8%.In addition,the RSDs for intra-and inter-day precision were 0.5%4.5%and 1.1%6.6%(n=6),respectively.The RSDs for repeatability ranged between 1.5%and 7.3%(n=6),and the RSDs for sample stability within 24 hours between 0.9%and 5.8%(n=6)within 24
12、h.In this method,the type and dosage of DSPE sorbent were optimized,and the influence of DSPE purification on the matrix effect was investigated.The results showed the matrix interference was effectively reduced by DSPE with PSA,and the sample pretreatment was easy to operate,efficient and cost-savi
13、ng.This method was successfully applied to the analysis of 46 ginsenosides in sun-dried ginseng,red ginseng and black ginseng.The results revealed that ginsenosides were transformed into rare ginsenosides in red ginseng and black ginseng due to steaming,and the contents of rare ginsenosides in black
14、 ginseng were much higher than those in red ginseng.The proposed method was accurate and reliable,fast,easy to operate,immune to impurity interference,and suitable for the simultaneous quantitative analysis of 46 ginsenosides in processed ginseng products.Keywords:Panax ginseng;processed products;gi
15、nsenosides;dispersive solid phase extraction;ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryDOI:10.7506/spkx1002-6630-20221016-147中图分类号:TS201 文献标志码:A 文章编号:1002-6630(2023)18-0305-11引文格式:王艳红,吴雨桐,曹虹芳,等.分散固相萃取结合UPLC-MS/MS测定不同人参加工品中46 种皂苷类化合物J.食品科学,2023,44(18):305-315.DOI:10.7506/sp
16、kx1002-6630-20221016-147.http:/WANG Yanhong,WU Yutong,CAO Hongfang,et al.Determination of 46 ginsenosides in different processed ginseng products by dispersive solid phase extraction combined with ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometryJ.Food Science,2023,44(18):305-315
17、.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-20221016-147.http:/人参是五加科植物人参(Panax ginseng C.A.Meyer)的干燥根和根茎,具有大补元气、复脉固脱、补脾益肾、生津养血、安神益智之功效1,是我国传统的名贵中药材,一直以来素有“中药之首,百草之王”的美誉。现代药物化学和药理学研究结果表明,人参中皂苷类物质是其主要的活性成分,具有抗肿瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖和增强免疫功能等多种药理作用2-3。人参皂苷根据在人参中的量被分为常量人参皂苷(主要人参皂苷)和稀有人参皂苷,常量人参皂苷
18、如人参皂苷Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg2、Rf等含有较多糖基、在人参中含量相对较高,但其生物活性较低,在人体内的吸收率也很低;稀有人参皂苷如人参皂苷Rg3、Rg5、Rg6、F4、Rh1、Rh2、Rh3、Rh4、Rk1、Rk2、Rk3、F1、F2等在人参属植物中含量很少,很难从人参属植物中直接分离得到,一般通过降解常量人参皂苷的方法制备稀有人参皂苷,但稀有人参皂苷含糖基较少,生物活性更好,身体吸收率更高4-5。此外,人参通过不同的加工方式,部分常量皂苷也会发生转化,产生稀有人参皂苷6-7。市场上最常见的人参加工产品为生晒参和红参,近年来,人参经过
19、九蒸九曝加工方法而成的黑参也逐渐出现在市场上,且由于黑参除了部分稀有皂苷含量较高,还含有一些特异性的稀有人参皂苷,并表现出更强的生物活性,越来越受到广大消费者的欢迎8。可见不同的加工方式引起了人参皂苷含量和种类的差异,对其药理活性和临床应用也有较大的影响。为此,评估人参皂苷水平对人参加工产品的质量控制和正确有效使用至关重要。而人参皂苷种类繁多,且结构具有多样性和相似性,针对人参相关产品复杂体系中多种皂苷类成分的快速鉴定及定量分析检测技术,国内外研究者们也一直在不断的探索和研究。近20年来,利用高效液相色谱法和超高效液相色谱法定量分析人参皂苷的含量已经是一种比较成熟的分析手段9-12,但由于检测
20、种类有限,分析时间较长,单一液相色谱方法难以满足人参及人参相关产品复杂体系中多种皂苷类成分同时快速分析检测。随着现代质谱技术的快速发展,液相色谱-质谱联用技术因其具有灵敏度高、分辨率好且高效快速便捷等优点已被广泛用于人参皂苷定性定量分析研究中。目前,虽然已有大量研究报道了应用液相色谱-质谱联用技术分析及鉴定人参皂苷类成分的检测方法,从液相色谱-质谱联用技术,到超高效液相色谱-高分辨质谱联用技术等。但既简单、准确、快速又覆盖皂苷种类多的定量检测分析方法还有限。三重四极杆质谱通常采用的多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM)模式需要已知的标准品优化仪器参数和对
21、分析物进行定量分析检测,具灵敏度高、选择性强的优势,更适用于已知物质的定量分析。成分分析 食品科学 2023,Vol.44,No.18 307如Xia Yonggang等13采用超高效液相色谱结合电喷雾电离和三重四极杆质谱分析测定了西洋参中22 种人参皂苷的含量;石婧婧等14建立了超快速液相色谱-三重四极杆/线性离子阱质谱法同时测定红参中17 种人参皂苷类成分;赵立春等15建立了人参中28 种人参皂苷含量的超高效液相色谱-质谱法(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)检测
22、方法。这些超高效液相色谱-三重四极杆质谱法,操作简单、快速准确,但是分析皂苷种类和数量覆盖面较窄,难以满足人参不同产品中皂苷类化合物复杂多样的分析检测要求。郝颖16和戴雨霖17等采用了高分离度快速液相色谱-四极杆-飞行时间质谱法分析鉴定了不同人参样品中40多种皂苷类成分;Lee等18采用超高效液相色谱-高分辨飞行时间质谱联用技术分析鉴定了人参根、茎、叶和果中的58 种皂苷类化合物。这些高分辨质谱法检测人参皂苷的多组分常采用飞行时间质谱检测器,具有超高的分辨率和精确分子质量测定功能,更适用于未知物质的定性鉴别。且超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪不仅价格昂贵,还需具备较高的专业技术水平等,在大部分
23、领域的应用仍处于发展阶段,大部分实验室仍未普及,液相色谱-三重四极杆串联质谱仪仍然是当前科研和检测机构的主流定量分析手段。由于人参不同产品中含有较多的糖类、脂类及色素等成分,为了降低基质的干扰,保证数据的准确性,并减少对色谱柱和仪器的污染,需要对其进行净化处理。目前最常见的人参皂苷前处理净化方法仍是传统的固相萃取法19-20、液液萃取法21-22,这些方法存在过程繁琐、耗时长、成本高、需要大量有毒有机溶剂等问题,且无法满足批量样品中多种皂苷的同时简单、快速、准确检测的需求。分散固相萃取法作为一种简便、快速、价格低廉的分析方法,已成功用于农药残留检测领域。近年来该方法在中药有效成分提取净化及分析
24、中的应用研究也有报道,如药用狗牙花中生物碱、五味子中木脂素23-24。但将分散固相萃取法用于人参中皂苷类成分净化分析方面的研究鲜见报道。本研究在前人研究基础上,采用了分散固相萃取法对人参样品进行净化处理,利用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪建立46 种皂苷类成分的检测方法,并对人参不同加工品中皂苷类化合物的含量和组成进行检测分析和比较。该方法进一步拓展了现有方法的检测范围,增加了样品前处理的净化技术和皂苷类化合物的检测种类,操作简便、快速,为不同人参加工品中多种皂苷类化合物的快速分析检测提供了技术参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂3 种人参加工品(生晒参、红参和黑参)为吉林省抚松万良人
25、参市场随机购买。46 种皂苷标准物质对照品(纯度均不小于95%)购于上海源叶生物科技有限公司和成都曼斯特生物科技有限公司。甲醇、乙腈(均为色谱纯)德国Merck公司;甲酸(色谱纯)美国Sigma-Aldrich公司;其他试剂均为分析纯。N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA)、十 八 烷 基 键 合 硅 胶(C1 8)吸 附 剂、石 墨 化 碳 黑(graphitized carbon black,GCB)吸附剂 北京恩加壹科技有限公司;实验用水为超纯水(Milli-Q纯水处理系统制备,美国Millipore公司)。1.2 仪器与设备Sep-pak C18固相萃
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