高效液相色谱-三重四极杆串联质谱法分析奶酪中5种生物胺.pdf
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1、基金项目:浙 江 省 基 础 公 益 研 究 计 划 项 目(编 号:L GN C )作者简介:张慧(),女,浙江科技学院正高级工程师,博士.E m a i l:z h a n g h u i c o m收稿日期:改回日期:D O I:/j s p j x 文章编号 ()高效液相色谱三重四极杆串联质谱法分析奶酪中种生物胺D e t e r m i n a t i o no f k i n d so f b i o g e n i ca m i n e s i nc h e e s e sb yh i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a
2、 t o g r a p h y t a n d e mm a s ss p e c t r o m e t r y张慧ZHANG H u i曹慧C A O H u i王瑾WANGJ i n肖功年X I A OG o n g n i a n姜侃J I ANGK a n(浙江科技学院生物与化学工程学院,浙江 杭州 ;浙江省产品质量安全科学研究院,浙江 杭州 )(S c h o o l o fB i o l o g i c a la n dC h e m i c a lE n g i n e e r i n g,Z h e J i a n gU n i v e r s i t yo fS c i
3、e n c e&T e c h n o l o g y,H a n g z h o u,Z h e j i a n g ,C h i n a;Z h e j i a n gI n s t i t u t eo fP r o d u c tQ u a l i t ya n dS a f e t yS c i e n c e,H a n g z h o u,Z h e j i a n g ,C h i n a)摘要:目的:为生物胺形成机制的研究和食品安全风险评估提供新的技术思路.方法:建立液相色谱三重四极杆串联质谱同时检测奶酪中酪胺、苯乙胺、色胺、章鱼胺和尸胺的 测定 方 法.采 用 超 声 辅
4、助 溶 剂 萃 取 生 物 胺,H I L I C色谱柱分离,三重四极杆质谱正离子多反应监测模式进行测定,内标法定量;研究提取溶剂种类、超声时间选择和基质效应对峰面积的影响,进行方法学验证和评估.结果:以甲酸乙腈水溶液为提取溶剂,超声提取 m i n,生物胺无需衍生化处理,以乙酸铵(甲酸调p H值为)乙腈为流动相,H P L C M S/M S直接测定.种生物胺的加标回收率为 ,相对标准偏差为 (n);色胺、苯乙胺、酪胺和章鱼胺的检出限为 g/k g,定量限为g/k g;尸胺的检出限为 g/k g,定量限为 g/k g;在各自线性范围内线性关系良好,相关系数均大于 .对市售奶酪样品进行测定,不
5、同样品中不同的生物胺含量差异较大,含量范围为 g/k g,均在安全范围内.结论:试验所建方法适合奶酪中种生物胺含量的快速检测.关键词:液相色谱三重四极杆串联质谱法;非衍生化;奶酪;生物胺;检测A b s t r a c t:O b j e c t i v e:An e wt e c h n i c a l i d e aw a sp r o v i d e df o rt h es t u d yo f b i o g e n i c a m i n e f o r m a t i o nm e c h a n i s ma n d f o o d s a f e t y r i s ka s
6、 s e s s m e n t M e t h o d s:A na n a l y t i c a lm e t h o dw a se s t a b l i s h e df o rd e t e r m i n a t i o n o f t y r a m i n e,p h e n y l e t h y l a m i n e,t r y p t a m i n e,o c t o p a m i n ea n dc a d a v e r i n ei nc h e e s e s w i t h h i g h p e r f o r m a n c el i q u i
7、dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e m m a s ss p e c t r o m e t r y(H P L C M S/M S)B i o g e n i c a m i n e s w e r e e x t r a c t e d b y u l t r a s o n i c a s s i s t e ds o l v e n te x t r a c t i o nf r o mc h e e s e s,a n dw e r es e p a r a t e db y H I L I Cc o l u m n,d e t e r m
8、i n e db yp o s i t i v ee l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o n(E S I)w i t hm u l t i p l er e a c t i o nm o n i t o r i n g(MRM)m o d e,q u a n t i f i e db yt h ei n t e r n a ls t a n d a r d m e t h o d T h ee f f e c to fe x t r a c t i o ns o l v e n tt y p e,u l t r a s o n i ct i m ea
9、n d m a t r i xe f f e c to nt h ep e a ka r e a w a ss t u d i e d,a n dt h ep e r f o r m a n c eo ft h em e t h o dw a sv a l i d a t e da n de v a l u a t e d R e s u l t s:U s i n gf o r m i ca c i d(a c e t o n i t r i l e/w a t e r)a st h e e x t r a c t i o n s o l v e n t,t h e s a m p l e
10、s w e r e e x t r a c t e d b yu l t r a s o u n df o r m i n Amm o n i u m a c e t a t eo f mm o l/L(p Hv a l u ew a sa d j u s t e d t ob y f o r m i c a c i d)a n da c e t o n i t r i l ew e r eu s e da st h em o b i l ep h a s e,b i o g e n i ca m i n e sw i t h o u td e r i v a t i z a t i o nw
11、 e r ed e t e c t e db yH P L C M S/M S T h er e c o v e r i e so fb i o g e n i ca m i n e sw e r e a n dr e l a t i v es t a n d a r dd e v i a t i o n s w e r e a tt h r e es p i k e dl e v e l s T h el i m i to fd e t e c t i o no ft r y p t a m i n e,p h e n y l e t h y l a m i n e,t y r a m i
12、n ea n d o c t o p a m i n e w a s g/k ga n dt h el i m i to fq u a n t i f i c a t i o nw a sg/k g;T h el i m i to fd e t e c t i o no fc a d a v e r i n ew a s g/k ga n dt h el i m i to fq u a n t i f i c a t i o nw a sg/k g T h e l i n e a r r e l a t i o n s h i pw a sg o o d i nt h er e s p e c
13、 t i v el i n e a rr a n g e s,a n dt h ec o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tw a sg r e a t e r t h a n T h em e t h o dw a su s e d f o r t h ed e t e r m i n a t i o no fc o mm e r c i a l l ya v a i l a b l ec h e e s es a m p l e s T h ec o n t e n t so fd i f f e r e n tb i o g e n i ca m
14、 i n e s i nd i f f e r e n t s a m p l e sv a r i e dg r e a t l y,r a n g i n g f r o m t o g/k g,w h i c h w a s w i t h i nt h es a f er a n g e C o n c l u s i o n:T h e p r o p o s e d m e t h o d w a s s u i t a b l e f o r f a s td e t e r m i n a t i o no f k i n d so fb i o g e n i ca m i
15、n e s i nc h e e s e K e y w o r d s:h i g hp e r f o r m a n c e l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y t a n d e m m a s ss p e c t r o m e t r y;w i t h o u td e r i v a t i z a t i o n;c h e e s e;b i o g e n i ca m i n e s;d e t e r m i n a t i o nF OO D&MA CH I N E R Y第 卷第 期 总第 期|年 月|生物胺是一类含氮低
16、分子量有机胺类化合物,常见的有酪胺、组胺、苯乙胺、尸胺、腐胺、色胺等,在多种食品如鱼、黄酒、火腿、豆瓣酱、干酪等中都有检出,一般认为是由于食品在加工或贮藏等过程中微生物产生的氨基酸脱羧酶对食品中的游离氨基酸进行脱羧基等作用而生成.生物胺的安全性和含量密切相关,适量的生物胺是体内的活性成分,而过量的生物胺则会引发系列过敏反应,如苯乙胺、酪胺和色胺可导致人体血压升高、偏头痛等症状,色胺还会增强其他生物胺的毒性;尸胺可引发恶心、咳嗽、呕吐等问题,还可与亚硝酸盐作用形成亚硝胺.奶酪中的生物胺含量和形成规律一直备受关注,刘蕾等 对 种中国传统干酪中生物胺进行了分析,不同样品中生物胺均有检出,含量为 m
17、g/k g.宋雪梅等 研究了牦牛乳干酪在成熟过程中生物胺的变化趋势和细菌群落的结构情况.这些研究大多采用高效液相色谱的方法进行生物胺的分析研究.当 前,食 品 中 生 物 胺 的 检 测 方 法 有 液 相 色 谱法 、高分辨质谱法、气相色谱质谱法、离子色谱法、薄层色谱法、液相色谱质谱法 等.常见的液相色谱法中,生物胺一般需要衍生化后再进行色谱柱分离和测定,样品前处理复杂、耗时长,并且在探索生物胺形成规律的研究中,存在早期低含量的生物胺无法准确监测的问题.L e e等 采用磺基水杨酸溶液提取米 酒 中的种 生 物胺,经 丹 磺酰 氯衍 生 后UHP L C M S/M S进行分析,定量限为 n
18、 g/m L.该法提高了检测的灵敏度,但前处理仍需繁琐的衍生化过程.H u a n g等 采用甲酸溶液提取豆瓣酱中的种生物胺,S P E小柱净化,C 柱分离,UHP L C M S/M S直接检测生物胺;Z h a n g等 采用高氯酸提取水产品中的生物胺,经净化和高氯酸溶液稀释,H S ST 色谱柱分离,H P L C M S/M S直接测定.以上两种研究方法均无需衍生化处理,大大提高了检测效率.但是仍然存在生物胺出峰不稳定,方法重现性差,以及强酸溶液易腐蚀质谱仪等问题.奶酪基质复杂,而适合奶酪中多种生物胺的高效提取、无需衍生化处理和稳定性好的快速检测方法尚未有相关研究.研究拟建立超声辅助溶
19、剂萃取、液相色谱三重四极杆串联质谱技术同时检测奶酪中种常见生物胺的测定方法,旨在为生物胺形成机制的研究和食品安全风险评估提供新的技术思路.材料与方法材料与试剂奶酪样品:随机购自超市和网店;酪胺(T y r a m i n e,T y r;C A S号 )、苯 乙 胺(P h e n y l e t h y l a m i n e,P h e;C A S号 )、尸 胺(C a d a v e r i n e,C a d;C A S号 ):纯度,北京曼哈格生物科技有限公司;色胺(T r y p t a m i n e,T r y;C A S号 )、章 鱼 胺(O c t o p a m i n e
20、,O c t;C A S号 ):纯度,北京曼哈格生物科技有限公司;庚胺内标(H e p t y l a m i n e,H e p;C A S号 ):纯度,阿拉丁试剂(上海)有限公司;乙腈:色谱纯,德国M e r c k公司;甲酸、乙酸铵:分析纯,国药集团化学试剂有限公司;试验用水为M i l l i Q超纯水.仪器与设备H P L C仪:L C A D型,日本岛津公司;三重四极杆串联质谱仪:Q T R A P型,美国A BS C I E X公司;电子天平:F A 型,上海舜宇恒平科学仪器有限公司;超纯水仪:M i l l i Q型,美国密理博公司;离心机:P型,德国S I GMR公司.方法仪
21、器条件()色谱条件:采用WA T E R SA t l a n t i sH I L I CS i l i c a色谱柱(mm mm,m)分 离,流 动 相A为mm o l/L乙 酸铵 溶液(p H值 为),B为 乙 腈;进 样 量 L;柱温;梯度洗脱程序见表.()质 谱 条 件:E S I正 离 子 模 式;多 反 应 监 测(MRM);喷雾电压为 V;离子源温度为 ;气帘气(N)为 k P a;雾化气(N)压力为 k P a;辅助加热气(N)为 k P a;在电喷雾正离子模式下对质谱参数进行优化.溶液配制()生物胺和内标标准储备液:准确称取各标准品 m g,用m o l/L盐酸溶剂配制质量
22、浓度为m g/m L表梯度洗脱程序T a b l eG r a d i e n t c o n d i t i o n so f l i q u i dc h r o m a t o g r a p h y时间/m i n流速/(m Lm i n)流动相体积分数/A乙酸铵B乙腈|V o l ,N o 张慧等:高效液相色谱三重四极杆串联质谱法分析奶酪中种生物胺的生物胺单标储备液.()种生物胺混合标准中间液:准确吸取各单标储备液,用甲酸乙腈溶液配制成质量浓度为m g/L(其中尸胺质量浓度为m g/L)的混合标准溶液,冰箱保存.()标准曲线:准确吸取上述混合标准溶液,采用甲 酸 乙 腈 溶 液 配
23、制 成 g/L或 g/L系列溶剂标准工作液,分别加入等量内标溶液.以标准品质量浓度为横坐标,以定量离子和内标离子的峰面积比值为纵坐标,绘制各标准曲线.提取溶剂的选择以奶酪样品为基质添加混标,分别采用乙腈、甲酸乙腈溶液、甲酸乙腈水溶液(V乙腈V水)各m L进行提取溶剂的比较研究,选择适合的提取溶剂.超声时间的选择以奶酪样品为基质添加混标,设定超声功率为 W,分别选取超声,m i n时间进行超声时间的研究,选择适合的超声时间.样品处理准确称取g研磨好的奶酪样品于 m L具塞离心管中,加入 L内标标准溶液,加入甲酸乙腈水溶液(V乙腈V水)m L涡旋振荡m i n,超声 m i n,r/m i n离心
24、 m i n,取乙腈水溶液层用 m滤膜过滤,待测.方法学验证选取奶酪样品,分别添加低、中、高个水平的种生物胺混标溶液,按照方法提取,同时设置空白对照试验,计算相对标准偏差和加标回收率.数据处理使用A n a l y s tS o f t w a r e软件进行质谱数据 采 集,M u l t i Q u a n t 软 件 进 行 数 据 分 析,M i c r o s o f tE x c e l进行数据处理.结果与分析色谱和质谱条件的优化色谱 条件 的优 化试 验考 察 了A t l a n t i s TM T(mm mm,m)、A d v a n c e B i o G l y c a
25、 n M a p(mm mm,m)、H I L I CS i l i c a(mm mm,m)种不同型号色谱柱的分离效果.结果表明,使用反相色谱柱T 柱时种生物胺均未出峰,说明在生物胺T 色谱柱上没有保留;正相色谱柱G l y c a n柱和H I L I C色谱柱上种生物胺均有出峰,但G l y c a n柱峰形较差,而经H I L I C色谱柱分离后生物胺得到较好的保留和峰形.生物胺是一类分子量较低、极性较强的化合物,H I L I C色谱柱的固定相是硅胶,是具有亲水作用的色谱,适合 分 离 亲 水 和 极 性 小 分 子 的 物 质.因 此,选 择H I L I C色谱柱进行生物胺的分离
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