高效液相色谱法分析黄芩汤配伍前后化学成分变化.pdf
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1、中南农业科技2023 年第 44 卷第 9 期2023 年 9 月中南农业科技South-Central Agricultural Science and TechnologyVol.44 No.9Sep.,2023许晨新,张景正,严宝飞,等.高效液相色谱法分析黄芩汤配伍前后化学成分变化 J.中南农业科技,2023,44(9):46-50黄芩为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensisGeorgi)的干燥根,黄芩汤源自张仲景的 伤寒论,是清热解毒的经典方剂1。此药方由黄芩、芍药、甘草和大枣4味药组成,具有清热止痢的功效2,现临床广泛用于治疗肠炎、痢疾和小儿腹泻等3-5。已有
2、研究表明,黄芩汤中的黄酮类、单萜及其苷类和三萜皂苷类成分为主要有效成分6,具有抑菌、解痉、解热、镇痛等药理作用7。虽然黄芩汤及其相关加减药方制剂应用广泛,如芍药汤、黄芩芍药汤等8,9,但其配伍机制仍未明确。关于黄芩汤不同配伍对其溶出物影响的研究报道较少10,对其配伍之后化学组分的变化研究不深入。基于药效成分的指纹图谱变化及多指标成分定性定量分析,是探讨中药复方配伍科学内涵的一种可行思路11。因此,本研究对黄芩汤及其减药方制剂进行分析,建立其 HPLC指纹图谱,并以药方中 6种成分为指标,通过高效液相色谱(HPLC)法分别对黄芩汤及其减药方的物质含量进行比较分析,为深入阐述黄芩汤药效物质含量及其
3、配伍机制提供参考。1材料与方法1.1材料黄芩汤中4味药材产自4个产地,购于安徽万生中药饮片有限公司,每袋 500 g,产地信息见表 1,经江苏卫生健康职业学院药学院中药教研室鉴定,各味药材均符合 中华人民共和国药典(2020版)的规定,黄芩为唇形科植物黄芩的干燥根,白芍为毛茛科植物芍药(Paeonia lactiflora Pall.)的干燥根,甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的干燥根和根茎,大枣为鼠李科植物枣(Ziziphus jujubaMill.)的干燥成熟果实。表1黄芩汤各味药材的产地信息药材黄芩白芍甘草大枣产地山西安徽甘肃新疆批号2201
4、012203022105012206011.2仪器和药品安捷伦1260 Infinity型高效液相色谱仪、AgilentZORBAX Extend-C18色谱柱(4.6 mm150 mm,5 m)(美国Agilent公司);X105BDU型十万分之一电子分析天平、ME104E 型万分之一电子分析天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Heraeus Fresco 21型高速冷冻离心机 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;HH-2型智能数显恒温水浴锅(南京华思旭科学仪器有限公司);KH5200B型超声波清洗器(昆山禾创超声仪器有限公司);默克 Milli-Q实验室纯水收稿日期:2023-03-04
5、基金项目:江苏卫生健康职业学院校级课题(JKC2022005);江苏卫生健康职业学院院级重点项目(JKB2021002);江苏省大学生创新创业计划项目(202114255005Y);江苏卫生健康职业学院校级课题(JKD202004)作者简介:许晨新(1994-),男,江苏句容人,助理实验师,硕士,主要从事中药物质基础及质量控制研究工作,(电话)18762542932(电子信箱);通信作者,刘嘉,副教授,硕士,主要从事药食同源品种研究与开发工作,(电子信箱)。高效液相色谱法分析黄芩汤配伍前后化学成分变化许晨新,张景正,严宝飞,刘嘉(江苏卫生健康职业学院药学院,南京211800)摘要:采用高效液相
6、色谱(HPLC)分析技术建立黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)汤配伍前后的指纹图谱及其中没食子酸、芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素6种化学成分的含量测定方法,并分析其配伍前后物质含量的变化。结果表明,所建立的黄芩汤配伍前后HPLC指纹图谱特征明显,黄芩汤配伍后,野黄芩苷含量升高,黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素3种成分含量降低,研究结果可为黄芩汤的配伍作用机制提供科学依据。关键词:黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)汤;高效液相色谱(HPLC)法;配伍;化学成分含量;指纹图谱;测定中图分类号:R284.1文献标识码:A文章编号
7、:2097-2083(2023)09-0046-05第 9 期仪(德国Milli-Q达姆施塔特默克集团)。没食子酸(批号C11987277,上海麦克林生化科技有限公司);芍药苷(批号 RP220609)、野黄芩苷(批号RP201015)、黄芩苷(批号RP200515)、黄芩素(批号 RP190604)、汉黄芩素(批号 RP200729)均购于成都麦德生科技有限公司,纯度均大于98%;乙腈(HPLC色谱级,Merk公司);甲醇(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);甲酸(分析纯,上海凌峰化学试剂有限公司),水为实验室自制超纯水。1.3试验方法1.3.1色谱条件Agilent ZORBAX Exte
8、nd-C18色谱柱(4.6 mm150 mm,5 m);流动相为 0.1%甲酸水(A)-乙腈(B);梯度洗脱,010 min,5%8%B,1020 min,8%16%B,2040 min,16%22%B,4050 min,22%B,5060 min,22%35%B,6070 min,35%55%B,7080 min,55%5%B;检测波长为273 nm;流速为 1.0 mL/min;柱温为 30;进样量为5 L。1.3.2混合对照品溶液分别精密称取没食子酸、芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素对照品适量,加甲醇超声至完全溶解,加超纯水定容后制成质量浓度分别为0.040、0.329、0.2
9、43、0.526、0.026、0.037 mg/mL的混合对照品溶液。1.3.3供试品溶液1)黄芩汤水煎液的制备。称取黄芩药材3.0 g、白芍药材2.0 g、甘草药材2.0 g、大枣药材2.0 g,加10倍量的超纯水浸泡30 min,回流提取1 h,过滤,滤渣再加8倍量超纯水,回流1 h,合并滤液,滤液定容至250 mL。提取液经 12 000 r/min离心后,过 0.45 m滤膜,即得。2)去黄芩减方制剂水煎液的制备。称取去黄芩的减方制剂,白芍药材2.0 g、甘草药材2.0 g、大枣药材 2.0 g,加 10倍量的超纯水浸泡 30 min,回流提取1 h,过滤,滤渣再加8倍量水,回流1 h
10、,合并滤液,滤液定容至250 mL。提取液经12 000 r/min离心后,过0.45 m滤膜,即得。3)阴性样品溶液的制备。根据处方比例,分别称取黄芩、白芍、甘草和大枣单味药材,按照黄芩汤水煎液的制备方法,制备各单味药材的阴性样品溶液,分别得到黄芩单煎液、白芍单煎液、甘草单煎液、大枣单煎液。1.4黄芩汤配伍前后HPLC指纹图谱的构建1.4.1 精密度试验按“1.3.3”方法制备黄芩汤水煎液,按“1.3.1”的色谱条件分别连续进样 6次,记录色谱图并计算各共有峰的相对保留时间和峰面积的RSD。1.4.2稳定性试验按“1.3.3”方法制备黄芩汤水煎液,按“1.3.1”的色谱条件分别在 0、4、8
11、、12、24、48 h进样测定,记录色谱图并计算各共有峰的相对保留时间和峰面积的RSD。1.4.3重复性试验称取同一批黄芩、白芍、甘草和大枣药材,按上述方法平行制备6份黄芩汤水煎液,按“1.3.1”的色谱条件分别进行测定,记录色谱图并计算各共有峰的相对保留时间和峰面积的RSD。1.5HPLC指纹图谱的构建构建黄芩汤、去黄芩减方制剂以及单味药材水煎液的 HPLC 指纹图谱,将其色谱图的 AIA 数据导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2012版),以黄芩汤(S1)图谱为参照,采用平均数法,时间宽度设置为0.1进行多点校正,色谱峰匹配得出对照图谱,以对照指纹图谱为参照进行相似度评价。1.6黄芩
12、汤配伍前后主要成分的HPLC测定1.6.1系统适应性试验精密吸取对照品溶液、黄芩汤水煎液和空白溶液,分别注入高效液相色谱仪进样分析,记录其色谱图。1.6.2线性关系考察分别精密吸取混合对照品溶液 1、2、4、8、10、20 L 注入高效液相色谱仪,按“1.3.1”的色谱条件进样分析,记录其色谱图。以对照品进样量(X)对峰面积(Y)进行线性回归分析。1.6.3精密度试验精密吸取混合对照品溶液5 L,按“1.3.1”的色谱条件连续进样6次,记录其色谱图,计算没食子酸、芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素6种成分峰面积的RSD。1.6.4稳定性试验精密吸取同一黄芩汤供试品溶液 5 L,按“1.
13、3.1”的色谱条件分别于 0、1、2、3 d 进样分析,记录其色谱图,计算没食子酸、芍药苷、野黄芩苷、黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素6种成分峰面积的RSD。1.6.5重复性试验分别称取黄芩、白芍、甘草和大枣药材,按“1.3.3”的方法平行制备 6份黄芩汤水煎液,按“1.3.1”的色谱条件分别进行测定,记录色谱图,并计算上述6种成分峰面积的RSD。1.6.6加样回收率试验取已知含量的黄芩汤方剂中4味药材9份,每3份一组,按高、中、低3个水平精密加入适量混合对照品溶液,按“1.3.1”的色谱条件进样测定,计算其加样回收率。1.6.7样品含量测定按“1.3.3”的条件制备样品溶液,按“1.3.1”的色谱条
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